【研究領域課題番号】19H02740 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNAアプタマー / キャピラリー電気泳動 / 次世代シーケンシング / 分子認識 / アプタマー選抜 / タンパク質 / 細胞 / 機械学習

【研究成果の概要】

近年，DNAアプタマー（分子認識する一本鎖DNA）の認識能が様々な分野で注目されている。既存のアプタマー獲得法では，ランダムDNAライブラリーから選抜操作を繰り返してアプタマー配列が得られるが，DNAアプタマーの性能の判別や機能の選抜はできない。また，高性能なアプタマーを取り逃がしている可能性が高い。本研究では，キャピラリー電気泳動法（CE）の高分離能と次世代シーケンサー（NGS）の配列決定能を組み合わせ，わずか１回の選抜操作での高速なアプタマー選抜を達成することを目指す。また，得られた大規模な配列情報から選択則に基づいてアプタマー配列を判別し，アプタマーの取り逃がしなく，性能予測をし，かつデータベース化できる新規手法（SR-CE選抜法）を確立する。
三年目である令和三年度は，分子ふるいCEによって構造形成型と構造非形成型のものに分割したランダムDNAライブラリーを用いてトロンビンタンパク質に対するSR-CE選抜を行い，それら二つのプール中の配列をNGS解析した。また，それらの配列を機械学習であるクラスタリングで分類し，かつそれら二つのプール配列を比較することで，それぞれのプールに特徴的な配列を見出すことに成功した。構造非形成型サブライブラリーに特徴的だった配列に対して，蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を起こす蛍光団を二重鎖を介して導入したところ，トロンビンタンパク質に結合した際に明確なFRET現象を起こした。すなわち標的と結合することで高次構造を誘起し，シグナルを発生するアプタマーを創り出すことに成功した。このようにSR-CE選抜によって，独特な高機能型アプタマーの選抜が可能であることを実証した。以上，三年間の研究で，SR-CE選抜はコンセプト通りの半網羅的かつ判定量的な高度な選抜法であることが分かった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,030千円 (直接経費: 13,100千円、間接経費: 3,930千円)

【研究領域課題番号】19K15692 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプトイド / ペプチド / 人工オリゴマー / タンパク質 / 分子認識 / N置換ペプチド / タンパク質リガンド / ３次元構造解析 / 固相合成 / フォルダマー / 立体構造解析 / 固相合成法 / 生体分子認識 / タンパク質間相互作用

【研究成果の概要】

本研究では、生体分子とくにタンパク質の精密認識を実現する人工オリゴマー分子の創出を目標に研究を実施した。ペプトイド（ペプチドもどき）として知られる分子の主鎖を改変するアプローチにより、特定の３次元構造を安定に形成する人工オリゴマー分子を創出することに成功した。この分子を用いることで、実際にタンパク質表面を認識する分子を創出することに成功し、分子生物学研究に有用なケミカルツールや創薬研究におけるシーズを提供する分子技術の基盤を築いた。

【研究の社会的意義】

タンパク質は、生体機能の発現に主要な役割を果たしており、その機能の自在に制御できる分子の創出は、分子生物学などの基礎研究や創薬のような応用研究において重要な研究課題である。本研究では、ペプトイドと呼ばれる人工分子の研究に着手し、最終的に、タンパク質表面を認識して結合する分子を創出することに成功した。このペプトイドの研究を今後さらに発展させることで、タンパク質機能を自在に制御可能となれば、生命科学分野の基礎研究および創薬における大きな波及効果があると考えている。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2019-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】17K07448 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 転写制御 / 分子認識 / GRASファミリー / 結晶構造解析 / IDDファミリー / 転写因子 / タンパク質間相互作用 / パターン形成 / 蛋白質 / 生体分子 / シグナル伝達 / 植物 / 発現制御

【研究成果の概要】

植物の根の形態形成に関与するGRASファミリーと転写因子IDDファミリーの相互作用に着目して、構造生物学的・生化学的手法を用いてより詳細な転写制御の分子機構の解析を行った。GRASファミリーのSCL3とIDDファミリー複合体のX線結晶構造解析を行った結果、既存のGRAS-IDD相互作用とは異なる新規の相互作用であることが明らかとなった。また、生化学的な解析から転写因子IDDファミリーとGRASタンパク質の組み合わせによって多数のタンパク質から構成される複合体が形成され、複雑な転写制御が行われている可能性が示唆された。

【研究の社会的意義】

植物の根の形態形成は成長過程と調和して転写制御をオン・オフにするため、複雑に制御されている。本研究では根の形態形成に重要な2つのファミリーGRAS, IDDファミリーについてその立体構造解析と分子相互作用解析の結果から、GRASファミリーとIDDファミリーの相互作用様式には多様性があることを示し、結合する組み合わせによって様々な転写制御複合体を形成し得ることを明らかにした。本成果は植物の複雑な転写制御機構の理解を深めると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】16H06693 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分子認識 / 多重特異性 / メチル基転移酵素 / 相互作用 / 物理化学 / 蛋白質 / 酵素 / 翻訳後修飾

【研究成果の概要】

本研究では、酵素の持つ多重特異性の分子機構についてアミノ酸残基レベルで知見を得ることを目的とし、多様な蛋白質の翻訳後修飾を担うメチル基転移酵素SMYD2を題材に研究を行った。SMYD2および基質タンパク質であるp53について、野生型および基質結合に関与していると考えられるSMYD2のアミノ酸残基に変異を導入した変異体を作製し、物理化学的手法によって相互作用解析を行うことにより、各アミノ酸残基の基質結合への寄与について定量的な知見を得ることができた。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2016-08-26 - 2018-03-31

【配分額】2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15K07023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / フォールディング / 天然変性蛋白質 / 分子認識 / NMR

【研究成果の概要】

天然変性蛋白質は、生理的条件下では特定の構造を持たず、標的蛋白質の認識・結合と同時にフォールディングする。高等生物が持つ蛋白質の多くが天然変性蛋白質であることから、それらの分子認識機構の決定因子を解明し、あらゆる天然変性蛋白質の分子認識機構を統一的に理解することが重要である。本研究により、1つの天然変性蛋白質内に誘導適合機構と構造選択機構という2つの仕組みが共存して標的分子を認識可能であるという画期的な成果が得られた。また、天然変性蛋白質の折りたたみやすさが標的分子認識機構の決定因子であることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】25249115 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

低分子創薬 / 熱力学解析 / フラグメントスクリーニング / 相互作用 / 蛋白質 / 低分子スクリーニング / 熱力学 / 生物・生体工学 / 分子認識 / 物理化学

【研究成果の概要】

本研究は、フラグメントスクリーニングにおいて、物理化学的な解析を行い、創薬の候補となりうるヒット化合物の選別とその親和性向上において有効な技術開発を行うことを目標とした。スクリーニングより得られた低分子化合物について、ITCやDSCによる熱量解析を行い、特異的な結合を示す化合物の選別(ヒットバリデーション)よりヒット化合物を得た。これらヒット化合物と蛋白質との複合体構造解析や分子モデリング解析結果を、熱量解析と共に議論することにより、１つの蛋白質に対してnMオーダーレベルのリガンドを創出することに成功した。このことから、本アプローチは新規の合理的設計戦略として有効な指針となると考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】41,210千円 (直接経費: 31,700千円、間接経費: 9,510千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】24657093 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 分子認識 / 銅イオン / 金属シャペロン / 蛋白質

【研究成果の概要】

銅イオンは必須微量金属の一つであり、タンパク質に結合することで各種の酵素活性の中心として機能している。一方で、遊離状態の銅イオンは活性酸素の発生を触媒することで毒性を発揮することがあるため、その細胞内動態は厳密に制御されねばならない。そこで本課題では、銅結合酵素であるSOD1への銅イオン輸送経路に着目し、細胞内での銅イオンの「流れ」を制御するメカニズムの解明を行った。特に、細胞内に銅イオンを取り込む輸送体であるCTR1と銅シャペロンCCSとの相互作用について解析を行い、SOD1への銅イオン供給を試験管内で再現することができるのかを検討することを最終的な目標として研究を進めた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】24780104 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

情報伝達 / フェロモン / ＮＭＲ / 立体構造 / 相互作用 / マウス / ＧＰＣＲ / ぺプチド / 構造生物学 / タンパク質 / NMR / GPCR / 分子認識

【研究成果の概要】

多くの生物は，種を保存するため，異性を正確に認識する情報手段として「フェロモン」を用いる。共同研究者である東京大学の東原らは，オスマウスの涙に分泌され，メスマウスの性行動を誘発するペプチド性フェロモン ESP1 を同定した（Nature, 2005）。また，鼻腔下部の鋤鼻器官にある GPCR クラス C 受容体の V2Rp5 を介して機能することを明らかにした（Nature, 2010）。
本研究代表者らは，ESP1の立体構造を決定し，その情報をもとに受容体との結合様式を明らかにした（JBC, 2013）。本研究により，哺乳類のペプチド性フェロモンと受容体の構造的知見を初めて得た。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】23570188 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / フォールディング / 分子認識 / 天然変性蛋白質 / 生物物理

【研究成果の概要】

「天然変性蛋白質」は、近年発見された新しいカテゴリーの蛋白質であり、単独では特定の構造を持たないが、標的分子を認識・結合するという機能発現と同時にフォールディング（構造形成）する。天然変性蛋白質は、高等生物が持つ蛋白質の約４割を占めることから、その分子認識機構の解明が重要課題となっている。本研究では、複数の天然変性蛋白質の標的分子認識機構を、核磁気共鳴（NMR）法などを用いて調べた。その結果、天然変性蛋白質は極めて高速で分子認識可能なことや、天然変性蛋白質に応じて誘導適合機構と構造選択機構といった機構で分子認識することなどが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】21360398 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 分子認識 / 生物・生体工学 / ナノバイオ / 天然変性 / 蛋白質間相互作用 / スクリーニング

【研究成果の概要】

天然変性蛋白質が示す新規な特異的相互作用と会合形成能に着目し、その機構を種々の物性・構造解析に加え、熱力学的解析および速度論的解析に基づいて記述した。具体的には、2つの天然変性蛋白質をモデルに、構造解析に加え、熱力学的および速度論的解析、変異導入解析により、標的分子・リガンドとの相互作用の相互作用機構、触媒機構を明らかにした。新規な添加剤系による蛋白質ハンドリング系を構築した。また、機能未知であった分子種については、in vivo解析からその機能を明らかにした。さらに、新規標的分子を用いた物質集積の制御、材料設計などボトムアッププロセスの工学的応用への展開の可能性を示した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】17687014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / ウイルス / 分子機械 / 複合体 / 分子モーター / 分子認識 / ウィルス / バクテリオファージ / DNAパッケージング

【研究成果の概要】

本研究は、T4ファージを対象として、DNAがウィルス頭殻に詰め込まれる現象を原子レベルで明らかにしようとするものである。本年度の成果は下記の通りである:
1.ネック蛋白質の発現・精製
ネック蛋白質(gp13,gp14)について、発現・精製を行った。gp13,gp14はそれぞれ、単独で精製することに成功し、それぞれが単量体で存在することがわかった。また、0.4M以上濃度の硫酸アンモニウム存在下で二つの蛋白質を混合すると、(gp13)_<10>-(gp14)_5からなる複合体が形成することがわかった。
2.ネック蛋白質の物理化学的解析
上記(gp13)_<10>-(gp14)_5の電子顕微鏡観察、超遠心分析を行いこの複合体が溶液中で均一のリング状の構造を持ち、ファージ粒子中に存在する複合体であることを示した。
3.結晶化、構造解析
gp13,(gp13)_<10>-(gp14)_5について、結晶化に適した精製試料を用いて結晶化を試みている。具体的には、市販のグローバルな結晶化条件スクリーニングキットを用いて、蒸気拡散法により結晶化条件の初期検索を行っている。現在、構造解析に向けて充分な質と大きさを持った結晶を得るための条件を探索中である。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】19,370千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 4,470千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15370065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バクテリオファージ / 分子機械 / 分子認識 / 分子集合 / 感染 / 超遠心分析 / X線結晶構造解析 / 微生物 / 超分子構造 / リゾチーム / テイルリゾチーム / 収縮姓尾部 / 感染機構 / バクテイオファージ / T4ファージ / プロセッシング / 蛋白質工学 / T4類縁ファージ / βヘリックス

【研究成果の概要】

本研究は、バクテリオファージの収縮性尾部を対象として、ナノマシーンとしての尾部の分子集合機構および作動原理を分子・原子レベルで明らかにしようとするものである。3年間の成果のうち、特に重要なものは以下の通りである。
パーデュー大学ロスマン教授のグループとの共同研究により、尾部収縮後の構造が電顕画像からの3次元像再構成によって明らかになった。収縮後の低分解能の電子密度にもこれまでに決定された7つの蛋白質の高分解能構造が無理なくあてはまったことにより、構造変化では個々のサブユニットの構造は大きく変化せず、主に配置変換によってマクロな構造変化が起こっていることが明らかである。さらに、この構造変化の主役を担っているのがgp10で、この蛋白質が長軸に関して回転することにより、それまでgp12(小尾繊維)に結合していたgp11が尾繊維(gp34)に結合することが分かった。
テイルリゾチームgp5はプロセッシングを受けて351残基目のセリンのC端で切断されるがこれをロイシンに置換したgp5は切断が起きないことが分かったので、この変異体を調整して構造決定を行うことが出来た。その結果、これまで明らかでなかった切断部位周辺の15残基の構造が明らかになり、また、隣のサブユニットから出ているペプチドが基質認識部位を占拠することによってリゾチーム活性を抑制している現象は切断の結果ではなく、切断以前に起こっていることが分かった。
T4類縁ファージKVP40のテイルリゾチームgp5の単離・性状解析およびgp27対応蛋白質の発見:テイルリゾチームgp5はリゾチームドメイン・C末端β-helixを含む特異な構造を有し、N末端ドメインでgp27と結合し、gp27を介して基盤と結合している。T4近縁のファージではgp5のドメイン構造は良く保存されているが、遠縁になるに従って類似性が低くなる。KVP40のgp5ではリゾチームが欠損している。このgp5をクローニング、発現、単離して、性状解析を行ったほか、通常のbalst検索では検出されないが、ORF334を候補と考えてクローニング・単離・精製を行ったところ、この蛋白質がgp5と強く結合することが確認された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】10359003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線 / 微小結晶 / 回折 / 蛋白質 / DNA / 結晶 / 複合体 / 分子認識 / 光学系 / ミラー / イメージングプレート / 構造生物学

【研究成果の概要】

実験室での生体高分子複合体用のX腺強度データ収集システムを構築した。本システムは、リガク(株)社製の回折計RAXIS-IVと微小焦点のX腺発生機FR-Cからなる。強2枚のイメージングプレートを用いて、度の読みとり時間は短縮するようになっている。X腺ビームはミラーで集光してある。本システムを用いて、蛋白質-DNA複合体、蛋白質-GTP複合体、蛋白質-蛋白質複合体のX腺強度データ収集と、それらの構造解析を行った。これらの複合体は、マウス由来の転写因子IRF-2とDNAとの複合体、分裂酵母由来の転写因子Pap1とDNAとの複合体、マウス脳海馬由来のセリンプロテアーゼNeuropsin、ヒト由来の低分子量G蛋白質RhoAとGTPγSの複合体、及びその標的蛋白質(蛋白質キナーゼ)であるPKNとの複合体、マウス由来の細胞膜-細胞骨格リンカー蛋白質radixinのFERMドメイン、及びそのドメインとIP3複合体とICAM-2複合体であり、それらの構造決定を通して、上記のデータ収集システムが有効であること示した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1998 - 2000

【配分額】24,000千円 (直接経費: 24,000千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】09308025 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / DNA / 分子認識 / 構造生物学 / X線 / 複合体 / 結晶 / 蛋白質-DNA / 転写因子 / G蛋白質 / 二成分系

【研究成果の概要】

本研究では、分子認識の厳密性と助長性という生物物理学の観点から、転写因子によるDNA認識、ならびにシグナル伝達蛋白質の分子認識に関して分子複合体結晶のX線結晶解析を主力とした構造生物学的研究を行った。転写系では、酵母由来のリン酸代謝系の転写因子PHO4、マウス由来のインターフェロン関連遺伝子の転写因子IRF-2、及び分裂酵母由来のbZIP型転写因子PaplのDNA複合体の構造をそれぞれ決定して、塩基配列認識の詳細な機構を明らかにした。シグナル伝達系では、細胞骨格・細胞接着を制御する低分子量G蛋白質RhoAのRhoA/GTPγS複合体及びその標的蛋白質PKNとの複合体の構造を決定して、Rhoに特異的な機能領域の構造や標的蛋白質認識の機構を明らかにした。また、原核細胞に特徴的なHis-Aspリン酸リレーでは、嫌気性条件センサー蛋白質ArcBのリン酸転移ドメインやそれに働く蛋白質フォスファターゼSixAの構造を決定した。更に、酸化ストレスとシグナル伝達系との境界領域での研究としては、ヘム結合能を持つとともに、新規の酸化ストレスの応答のペルオキシダーゼ(ペルオキシレドキシン)であるHBP23の構造や、細胞外のシグナル制御系として、マウス海馬に高発現し記憶や学習に関与する新規セリンプロテアーゼであるニューロプシンの結晶構造を決定した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】33,300千円 (直接経費: 33,300千円)