【研究領域課題番号】20H03847 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リプログラミング / 創傷治癒 / 遺伝子導入 / アデノ随伴ウイルスベクター / 再プログラム化 / 遺伝子治療 / 皮膚潰瘍 / 直接転換 / 上皮化 / 組織胎児化 / 難治性潰瘍

【研究成果の概要】

本研究では申請者が開発を進めてきた「皮膚潰瘍に存在する間葉系細胞から上皮細胞への細胞系譜の転換を介して、潰瘍面から直接的に上皮化、創傷の閉鎖をはかる皮膚潰瘍治療法」の臨床応用へ向けた研究開発を進めている。
特に皮膚皮下組織の間葉系細胞に特化した指向性を有するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を開発する目的で、AAVの一部をランダム化したペプチドディスプレイウイルスライブラリを作成し、マウス皮膚潰瘍面を用いた定方向進化法をかけることによって新しいカプシドを開発した。Deep learningによる病理組織解析手法を導入することによって動物間のばらつき、実験手技によるばらつきの影響を最低限に抑えながら、定量的に比較検討を行う方法について最適化を進め、新規開発したAAVカプシドの既存カプシドに対する優位性を確認した。また、類似の原理に基づいて、誘導された上皮に対して遺伝子導入を行うための新規AAVカプシド候補セットを開発した。
一方、複数の転写因子を単一の細胞に対して同時に遺伝子導入するためのポリシストロニックベクターの開発を目的として、転写因子セットの全配列順に連結したウイルスベクターコンストラクトを作成し、ヒト・マウス細胞を用いてin vitro細胞系譜転換実験を行い、転換効率の観点から細胞系譜転換に最適な配列順が明らかとなった。当該ポリシストロニック配列を搭載することが可能な大容量ウイルスベクター作成を目的としたバックボーンプラスミドコンストラクト作成を進めた。
そのほか、皮膚潰瘍面への遺伝子治療臨床応用に際しての障壁として危惧されるOff target効果を最低限とするための新しい化学物質を用いたコントロールリリース法、長期的に実験・観察が可能な新規皮膚潰瘍動物モデルの開発と解析を進めた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究領域課題番号】18K19599 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血管奇形 / 遺伝子治療 / ゲノム編集 / 動物モデル / 遺伝子導入 / アデノ随伴ウイルスベクター / 血管腫 / 体性突然変異 / モザイク変異

【研究成果の概要】

体表・軟部組織の血管奇形の病態解析、治療的介入方法の開発のため、「Creリコンビナーゼの作用時期調整」、「複数のLoxP配列を用いた確率論的な変異遺伝子の組み換え」、「ゲノム編集」を組み合わせて用いたシステムのデザインを進め、pUC19ベクターにクローニングしたマウスゲノム配列上に、クローニング作業を進めた。また、in vivoでマウスの血管内皮細胞のゲノムを編集する方法として、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)に着目し、野生型の状態で血管内皮細胞に最大の指向性を有するカプシドを明らかにし、指向性にかかわる部位にバリアント配列を導入するための改変カプシドプラスミドを作成した。

【研究の社会的意義】

体表・軟部組織の血管奇形は、従来、血管腫として呼ばれていた疾患群であり、特に広範な病変を有する症例においては整容的、機能的障害に加えて疼痛、出血などの症状を呈することから終生にわたって、外科的治療や血管内治療を繰り返す必要があり、既存の治療には限界がある。本研究によって開発した技術は、実際の症例に即した動物モデルを作成し、変異を有する病変内のゲノムを修復する、新しい治療開発を進める礎となる。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2018-06-29 - 2020-03-31

【配分額】6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)

【研究領域課題番号】18K08047 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

心筋再生 / 心筋症 / 心筋リプログラミング / 心筋リプロウグラミング / 遺伝子治療 / リプログラミング / 遺伝子編集 / 心筋梗塞 / リプロウグラミング / 直接リプログラミング / 遺伝子導入 / 再生医療 / プログラミング / 直接誘導

【研究成果の概要】

本研究より、効率的に 維芽細胞から心筋梗塞 に効率的に遺伝子導入をする方法を探索している。その中で、共同研究を行った心筋梗塞での治療として、細胞のゲノムを損傷することなく 3つの心筋 誘導遺伝子を導入して、心筋梗塞 の心臓線維芽細胞を直接的に心筋細胞へ転換して、心機能を改善することに成功した。2020年以降、細胞移植を必要としない新しい心筋再生法として、心筋以外の心臓線維芽細胞に心筋誘導遺伝子を導入して、心筋を直接作製する研究を行っている。
本研究では、 張型心筋症やファブリー病の伝性心筋症にも注目をして、心筋直接誘導が改善できるコンストラクトを作成している。

【研究の社会的意義】

本研究では、単に心筋梗塞だけではなく、張型心筋症やファブリー病の伝性心筋症にも注目をして、心筋直接誘導が改善できることを目標として、条件検討を行っている。
その結果により、遺伝性の心筋症の患者に対しても、細胞移植を必要としない新しい心筋再生方法を確立することが期待できる。
よって、この心筋直接リプログラミングによる心筋再生技術は、iPS細胞誘導心筋細胞移植とは異なる、再生医療への用途が期待できるようになる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】14370307 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

AAVベクター / 組織特異性 / 蛋白質補充遺伝子療法 / 染色体部位特異的遺伝子組込み / Rep / ITR / アデノウイルスベクター / アダプター分子 / エリスロポエチン / 凝固因子 / 免疫反応 / 遺伝子治療 / 遺伝子導入 / 血清型 / AAVS1領域 / TVI法

【研究成果の概要】

非病原性のアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するAAVベクターは安全性が高く、標的細胞としては、筋細胞・肝細胞・神経細胞などの非分裂細胞が適している。最近、AAVの血清型と組織特異性の関係が注目されている。また、AAVのユニークな特徴の一つとして、ウイルスゲノムが宿主細胞の染色体DNAに部位特異的(19q13.3-terに存在するAAVS1領域)に組み込まれることが知られている。そこで、AAVを利用した遺伝子導入法の基盤テクノロジーとして、以下の研究を実施した。1)AAVベクターの構築(血清型/プロモーター)と組織特異性に関する検討:AAV-1〜5に由来する各カプシドと種々のプロモーターを持ったAAVベクターを作製し、蛋白質補充遺伝子療法のための至適AAVベクターの構築を検討した。その結果、骨格筋では1型のベクターとCMVプロモーターの組み合わせが、肝臓では5型のベクターとCAGプロモーターの組み合わせが良好であった。ベクターを注入した筋組織には全く異常を認めなかった。2)AAVのコンポーネント(ITR配列とRep遺伝子)を利用した第19番染色体部位特異的遺伝子組込み(TVI)法の開発:Cre-loxP法によりRepの発現を制御したアデノウイルスベクターを構築し、このベクターにITRを連結したマーカー遺伝子を同時に搭載することを計画した。このシステムが働くことを、構築したプラスミドのトランスフェクションによるモデル実験で明らかにした。また、アデノウイルスベクターによる未分化造血系細胞への遺伝子導入効率を高めるために、アダプター分子(CAR-SCF)を作製した。CAR陰性c-Kit陽性の細胞株MO7eを用いた実験で、その有効性を確認した。この染色体部位特異的遺伝子組込み法が確立すれば、将来的にはヒトES細胞への応用が考えられ、重要なテクノロジーに発展する可能性がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】14,200千円 (直接経費: 14,200千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】14370299 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

PNH / 遺伝子治療 / 遺伝子導入 / PIG-A / VSV-Gシュードタイプレンチウイルスベクター / GPIアンカー欠失K562細胞 / マキシザイム / ランダムリボザイムライブラリー / 臍帯血CD34細胞 / GFP遺伝子 / 発作性夜間血色素尿症 / PIG-A遺伝子 / K562細胞株 / Musashi1 / NOD / SCID / 造血幹細胞 / マウス白血病ウィルスベクター / 水疱性口内炎ウィルスG蛋白 / K562白血病細胞 / VSV-Gシュードタイプレンチウィルスベクター

【研究成果の概要】

発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)はphosphatidylinositol glycan-class A(PIG-A)遺伝子変異によりもたらされることが明らかになってきた。本疾患は溶血のみならず血栓症、易感染性、造血不全、白血病化などの多彩な病態を呈する予後不良の造血幹細胞異常疾患であることから、細胞療法や遺伝子治療の標的と考えられている。我々は特に遺伝子治療の観点より本疾患を検討することにした。本研究期間内に行った研究は、(1)正常PIG-A遺伝子を効率よくヒト造血幹細胞に導入することを最終目的にVSV-Gシュードタイプレンチウイルスベクター(V-LV)を用いて各種造血細胞に標識遺伝子であるGFP遺伝子を導入し、ヒト造血幹細胞に効率良く遺伝子を導入できることを示すことができた。(2)正常PIG-A遺伝子導入V-LV(PIG-LV)を構築し、GPIアンカー欠失K562細胞へ遺伝子導入をし、本細胞におけるCD55、CD59遺伝子発現の回復を確認した。(3)大学内倫理委員会の承認を得た後、文書にて同意が得られたPNH患者2名の骨髄幹細胞を採取し、免疫不全マウスであるNOG(NOD/SCID/γcnull)マウスに骨髄内移植を行い、ヒトPNHモデルを作出中である。(4)PIG-LVを用いてin vitroにおいて患者造血幹細胞へのPIG-A遺伝子導入効率を検討中である。(5)最近、PNHの病因としてPIG-A以外にも異常症遺伝子が関与している可能性が示唆されている。われわれは未知のPNH病因遺伝子を現在V-LVベクターを用いたランダムリボザイムライブラリーを作製中である。(6)リボザイムの進化型であるマキシザイムをV-LVを用いてヒト造血細胞内で発現できることを確認し、急性リンパ性白血病の原因遺伝子であるbcr/abl融合遺伝子の破壊が可能で抗白血病効果があることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】14,000千円 (直接経費: 14,000千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】12557207 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子導入 / 正電荷コレステロール / 正電荷リポソーム / 非ウィルスベクター / 顕微光学法 / エンドサイトーシス / バイオサーファクタント / 遺伝子治療 / 非ウイルスベクター / 膜融合

【研究成果の概要】

正電荷コレステロールを素材とした非ウイルスベクター(正電荷リポソーム)の開発を行い、遺伝子治療における基盤技術の確立と展開を行った。同時に、外来遺伝子の細胞内動態を解析する顕微光学技術を開発し、遺伝子治療研究への展開を行った。特に、水酸基を末端に持った正電荷コレステロール誘導体の有効性を明らかにするとともに、非ウイルスベクターによる外来遺伝子の導入機構(エンドサイトーシス、膜融合、核シグナルの寄与)を解明した。具体的な研究成果は次の8項目に大別できる。(1)高効率の非ウイルスベクターを遺伝子導入に利用する技術の確立。(2)顕微工学法による外来遺伝子の細胞内動態の解明。(3)バイオサーファクタントを用いた高効率の非ウイルスベクターの開発。(4)バイオサーファクタントによる遺伝子導入機構の解明。(5)プロタミンによる遺伝子導入効率の増進と、そのメカニズムの解明。(6)プロタミンによるDNA・正電荷リポソーム複合体のコンパクト化とそれによる核膜孔通過促進の可能性の提示。(7)核移行シグナルによる外来遺伝子の核移行の促進。(8)NGF、EGF等の受容体(レセプターチロシンキナーゼ)の活性化による遺伝子導入効率の増強。これら多くの多様な研究成果は細胞機能解明の基礎研究に大きく寄与するだけでなく、遺伝子導入の基礎技術と臨床応用(遺伝子治療)への展開に大きく寄与すると判断された。また、外来遺伝子(DNA)の核移行には細胞骨格蛋白質の動態が密接に関与している事も明確にした。これらの一連の研究成果は正電荷コレステロール誘導体を素材とした正電荷リポソームの遺伝子治療の研究に画期的な寄与をすると判断された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】8,900千円 (直接経費: 8,900千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12671154 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

冠動脈バイパス / 動脈硬化 / 静脈グラフト / 遺伝子導入 / アデノウィルス / ナトリウム利尿ペプチド / アデノウイルス / 遺伝子治療 / C型ナトリウム利尿ペプチド

【研究成果の概要】

C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)は血管平滑筋上の特異的受容体(ANP-B受容体)を通して血管平滑筋弛緩、増殖抑制に働く。われわれはCNP遺伝子を非増殖性アデノウイルスに組み込んだベクターを作成し、このベクターが培養血管平滑筋細胞に対して非常に高い遺伝子導入効率を示し、強力な増殖抑制作用を持つことを明らかにした。これを踏まえて本研究ではまずウサギ頸動脈のバルーン障害モデルを用いて、血管内皮障害時に遺伝子導入を行うことにより、血管内皮障害後の新生内膜肥厚が著明に抑制されることを明らかにして報告した。さらに新生内膜における血管平滑筋細胞の表現型、血管内皮細胞の再生を検討した結果、CNPの過剰発現により、増殖刺激された血管平滑筋細胞の再分化が認められ、血管内皮細胞の再生が促進されることを明らかにして報告した。さらにウサギ頚静脈の動脈化グラフトモデルにおいて、移植前の自家静脈グラフトに対してex vivoにCNP遺伝子導入を行い、移植後のグラフト内膜肥厚、血栓形成、内皮再生について検討した。遺伝子導入を行った静脈グラフトでは血管壁におけるおよび二次伝達物質であるcGMPの濃度は対照群に比べ有意に高値であった。その結果、CNP遺伝子導入群では対照群に比べ、静脈グラフトの内膜肥厚が有意に抑制されると共に、血栓形成の抑制、内皮再生の促進効果が認められた。現在ビーグル犬において内胸動脈および下肢静脈を用いて冠動脈バイパスを行い、これらのグラフトに対するCNP遺伝子導入の効果を検討中である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】09470192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

表皮水疱症 / 遺伝子治療 / 培養表皮 / ラミニン5 / VII型コラーゲン / 出生前診断 / 基底膜 / 表皮 / Vil型コラーゲン / 培養表皮シート / 遺伝子導入 / 劣性栄養障害型 / Herlitz致死型 / laminin5 / SV40

【研究成果の概要】

本研究の目的は、表皮水疱症という疾患を対象にして、遺伝子治療の対象臓器として多くの利点を持つ培養表皮シートを媒体とした,新しい遺伝子治療システムを実用化させるための基礎研究を行うことであった。
今回の研究では、劣性栄養障害型においては患者皮膚におけるVII型コラーゲンの発現、Herlitz致死型においてはlaminin5の発現をそれぞれ免疫組織学的,生化学的に蛋白レベルで検討した。つづいて、各症例における遺伝子変異部位をPCR,Heteroduplex,direct sequencing法などを用いて同定した。さらにこれらのデーターに基づき、出生前診断を行うなど、実際の臨床応用にも貢献した。これらの結果は、業績に示すような論文誌上に於いて報告した。
遺伝子レベルで父方,母方の両方のallellesにpremature termination mutationを有し、蛋白レベル、mRNAレベルで遺伝子発現が全く認められないような重症表皮水疱症症例を選択し、一部の患者の皮膚を培養表皮細胞実験に用いた。
すなわち、Herlitz致死接合部型表皮水疱症患者から得られた小皮膚片より、表皮細胞を培養し、SV40によりtransformさせ、不死化細胞株を樹立した。続いて、LAMB3遺伝子のfull lengthを作製、ベクターへ組込み、SV40不死化細胞株に遺伝子導入を行った。遺伝子導入効率をチェックしたところ、LAMB3遺伝子がHerlitz致死接合部型表皮水疱症の培養表皮細胞株に組み込まれて、ラミニン5のβ鎖が発現していることが確認された。
本研究により得られたこれらの基礎データーは、培養表皮細胞を用いた遺伝子治療モデルの開発に今後大きな助けとなるものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】13,100千円 (直接経費: 13,100千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】09557059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分化 / 血管内皮細胞 / 血管平滑筋細胞 / 神経堤細胞 / ウイルスベクター / 遺伝子導入 / エンドセリン / 遺伝治療 / 神経提細胞 / 遺伝子治療

【研究成果の概要】

増田は、神経病原性マウスレトロウイルスPVC-211が他のウイルスに比べてラット血管内皮細胞への遺伝子導入効率が高いこと、また、標的となる内皮細胞を2-デオキシグルコースで前処理し、ヘパリン非存在下でベクターウイルスを接種するとさらに導入効率が上がることを見出した。また、可逆的遺伝子導入が不可能であるというレトロウイルスベクターの問題に対処するため、Cre-loxP相同組換えを利用した2種類の新規レトロウイルスベクターを開発した。一つは、ベクター内構造のCre依存性逆位により導入遺伝子の発現を可逆的に制御する“Flip-Flop"型ベクター、もう一つはLTR内にloxP配列を持ち、Cre依存性に導入遺伝子を除去できる切り出し可能型ベクターである。後者はプロウイルス組込み部位の宿主ゲノムや、ベクターによる挿入変異の影響の解析にも有用である。
栗原らは、マウス胚由来の初代培養神経堤細胞から血管平滑筋細胞への分化をex vivoで誘導しうる系を確立した。また、この培養系を利用して、平滑筋細胞コロニー形成がエンドセリン(ET-1)に依存すること、FGF-2は平滑筋分化を抑制し、BMP-2およびBMP-4による分化促進効果とは対照的であることなどを明らかにした。さらに、ET-1ノックアウトマウスの解析から、ET-1がbHLH型DNA結合蛋白であるdHANDの発現維持を介して血管系発生分化の制御に関与している可能性を示した。
以上2カ年の研究により(1)心血管系平滑筋幹細胞の初代培養・分化誘導系の確立と解析、(2)心血管系細胞への可逆的遺伝子導入用ベクター系の開発を達成した。今後はこれらの成果を応用し血管平滑筋細胞への分化能を保持した株化細胞を樹立し、心血系疾患の遺伝子治療動物モデルを作成していく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】11,800千円 (直接経費: 11,800千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】08457202 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エンドセリン / ジーンターゲティング / 血管形成 / 血管リモデリング / トランスジェニックマウス / 遺伝子導入 / 組織特異性 / 遺伝子治療

【研究成果の概要】

血管形成・リモデリング機構の解明のため、本研究ではまず、血管系特異的な遺伝子発現系の確立を目的とし、エンドセリン-1(ET-1)遺伝子プロモーター領域を用いた血管壁選択的遺伝子発現トランスジェニックマウスを作成した。
1.エンドセリン-1(ET-1),アドレノメデュリン(AM)過剰発現マウス:ET-1過剰発現マウスの組織・血中ET-1濃度は野生型マウスの2〜4倍で、低体重と体毛の減少を認めたが、無麻酔無拘束下またはウレタン麻酔下での観血的動脈圧は野生型に比べ差はなく、生理的にみられる程度のET-1の産生増加は、慢性期では血圧レベルに影響しないと考えられた。AM過剰発現マウスのうち1系統は、大動脈AM濃度は野生型マウスの約10倍であった。
2.血管系選択的コンディショナル遺伝子発現マウス:テトラサイクリン反応性オペレーター遺伝子配列(tetO)にレポーター遺伝子(LacZ)を結合したコンストラクト(A)、ET-1プロモーター領域9.2kbにテトラサイクリンプレッサー蛋白(tetR)とVP16C末転写活性化領域の融合蛋白を結合したコンストラクト(B)をそれぞれ作成し、A・Bそれぞれより各々複数のラインを得た。tetOによるLacZ発現をin vitroで確認した後、現在それぞれの系の交配を進め、両方のコンストラクトが組み込まれたマウスの樹立行っている。
以上から、この血管壁遺伝子発現系による遺伝子発現は生理的産生量に匹敵もしくは凌駕するレベルを示し、血管系における遺伝子機能解析への高い応用性が示された。さらに、コンディショナル遺伝子発現系の応用により、血管系でのテトラサイクリンによるON-OFFの調節が期待される。現在、ウイルス系ベクターを用いた遺伝子導入へ向けての準備を進めている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)

【研究分野】応用薬理学・医療系薬学

【研究領域課題番号】07557313 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

スーパーオキシドディスムターゼ / 遺伝子治療 / in vivo実験 / 遺伝子導入 / 活性酸素 / 細胞障害 / ex vivo法 / 炎症 / スーパーオキシドティスムターゼ / 肺

【研究成果の概要】

近年、小児や成人における呼吸窮迫症候群に活性酸素消去酵素であるヒトスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)を投与することにより肺組織傷害が軽減されることが報告されているが、それほど大きな効果が得られていない。これはSOD自体の体内半減期が著しく短く、加えて、肺に特異的に分布させることが困難なためと考えられる。
また様々な遺伝子を導入した細胞を移植または直接遺伝子を投与することで遺伝子疾患や癌などを治療しようとする試みが近年活発に行われ、その有効性が証明されつつある。そこで本研究はヒトSOD遺伝子をラット細胞に組み込み、これまでほとんど検討されていない高濃度SOD発現ラット細胞を実験動物に直接経肺投与することにより、肺組織局所部位でのSODを濃度を高め、SOD遺伝子治療の有用生を明らかにすることを目的として実験を行った。
このためには細胞内蛋白であるSODを分泌型蛋白とすることが必要とされる。そこで、IL2シグナル配列とヒトSOD cDNAからILSOD cDNAsを構築することにより、異種蛋白質の分泌シグナルをDNAレベルで付加することによる非分泌性蛋白質の分泌化の可能性が明らかとなった。
また、得られたILSOD cDNAsを導入した皮膚線維芽細胞ならびに肺上皮細胞は、顕著な活性酸素毒性防御作用を示すことがin vitro実験において明らかとなった。さらに、in vivo実験、すなわち寒冷浮腫ならびにカラゲニン誘発足浮腫に対してILSOD(1)cDNA導入線維芽細胞を移植する事により、顕著な浮腫抑制効果が得られるとともに、ヒトSOD蛋白質の静脈内投与または皮下投与に比較して、その作用が顕著に持続化することを認めた。
さらにILSOD(1)cDNA導入肺上皮細胞を胸腔に移植することによりパラコートにより惹起される肺組織傷害の改善されることが明らかとなった。
従って、このようなex vivo遺伝子治療法を応用した細胞性製剤の開発が、ペプチドならびに蛋白質のDDSとして有用であるという結論を得た。これらの結果は、今後ますます注目される生理活性ペプチドならびに蛋白質医薬品を、持続的かつ効率よく体内標的部位へe嵐BするためのDDSの開発に対して有益な知見を与えるものと考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】1,400千円 (直接経費: 1,400千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】07407020 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子導入 / 心血管系 / トランスジェニックマウス / 組織特異性 / 遺伝子プロモーター / ウイルスベクター / 循環器疾患 / 遺伝子治療 / ウィルスベクター

【研究成果の概要】

平成7・8年度の研究において、我々は、エンドセリン-1(ET-1)遺伝子プロモーター領域を用いた血管壁選択的遺伝子発現系を確立し、これを用いたトランスジェニックマウスを作成した。
1.エンドセリン-1(ET-1),アドレノメデュリン(AM)過剰発現マスウ:ET-1過剰発現マウスの組織・血中ET-1濃度は野生型マウスの2〜4倍で、低体重と体毛の減少を認めたが、無麻酔無拘束下またはウレタン麻酔下での観血的動脈圧は野生型に比べ差はなく、生理的にみられる程度のET-1の産生増加は、慢性期では血圧レベルに影響しないと考えられた。AM過剰発現マウスのうち1系統は、大動脈AM濃度は野生型マウスの約10倍であった。
2.血管系選択的コンディショナル遺伝子発現マウス:テトラサイクリン反応性オペレーター遺伝子配列(tetO)にレポーター遺伝子(LacZ)を結合したコンスラクト(A)、ET-1プロモーター領域9.2kbにテトラサイクンリプレッサー蛋白(tetR)とVP16C末転写活性化領域の融合蛋白を結合したコンストラクト(B)をそれぞれ作成し、A・Bそれぞれより各々複数のラインを得た。tetOによるLacZ発現をin vitroで確認した後、現在それぞれの系の交配を進め、両方のコンストラクトが組み込まれたマウスの樹立行っている。
以上から、この血管壁遺伝子発現系による遺伝子発現は生理的産生量に匹敵もしくは凌駕するレベルを示し、血管系における遺伝子機能解析への高い応用性が示された。さらに、コンディショナル遺伝子発現系の応用により、血管系でのテトラサイクリンによるON-OFFの調節が期待される。現在、ウイルス系ベクターを用いた遺伝子導入へ向けての準備を進めている。
3.これとともに、我々は平滑筋・心筋ミオシン重鎖遺伝子をクローニングし、それらのプロモーター領域のin vitroにおける組織特異的転写活性調節機構を明らかにしてきた。これらをレポーター遺伝子に連結した遺伝子コンストラクトを作成し、平滑筋や心筋に特異的な遺伝子発現をするトランスジェニックマウスの作成を試みている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】36,800千円 (直接経費: 36,800千円)