【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】15K13750 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオーム / 質量分析 / プロテオミクス

【研究成果の概要】

細胞の機能を調節している転写因子などの重要なタンパク質のおおくは、細胞内で微量にしか発現していないことが多く、これらを質量分析によって検出することは困難であった。そこで、無細胞翻訳系を用いた簡便な同位体標識標準ペプチドと、静電相互作用、疎水性相互作用を用いたクロマトグラフィーによる多次元の分離により、標的タンパク質フラグメントの純度を高めることで、微量タンパク質の高感度な絶対定量法であるMS-QBiC法を確立した。これにより１細胞内に数千分子しか存在しない概日時計の転写因子の増減を定量的に検出することに成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】26461880 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Proteomics / STK38 / Radiation sensitivity / DNA damage responses / DNA損傷応答 / プロテオーム / リン酸化 / DNA損傷シグナル / DNA二重鎖切断 / 放射線感受性 / 放射線応答

【研究成果の概要】

研究代表者の複合体形成と機能プロテオーム情報を基盤とした放射線感受性制御のメカニズムの研究においては、放射線によって活性化するタンパク質リン酸化酵素STK38がCDC25Aの76番目のセリン残基をリン酸化すること、STK38 shRNA発現ベクターを導入して、STK38を発現抑制させたノックダウン細胞ではX線照射後のCDC25Aのリン酸化やG2/M期の細胞の割合が減少していることが明らかとなった。さらにSTK38ノックダウン細胞ではX線感受性が亢進していた。これらのことからSTK38はCDC25Aのリン酸化を介したG2チェックポイントや放射線感受性の制御に関わっていると考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】21710223 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオミクス / クマムシ / 極限環境耐性 / 乾眠 / 放射線耐性 / クロマチン / 抗凝集性 / 円偏光二色性 / タンパク質 / プロテオーム / 蛋白質 / 動物 / 親水性

【研究成果の概要】

ヨコヅナクマムシの持つ高い乾燥耐性・極限環境耐性を支えるタンパク質の候補として、加熱しても凝集しないクマムシ固有のタンパク質群を初めて同定しこれらのタンパク質群が乾燥前から大量に発現していることを明らかにした。また、同様の性質を持つタンパク質が乾燥耐性の弱いクマムシにおいても存在することを見出し、その凝集温度と乾燥耐性との間に一部相関関係が見られることを明らかにした。また、放射線耐性に関わるタンパク質の候補として、クマムシのクロマチン分画を分離し、中に含まれるタンパク質群を同定した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】21591441 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

皮膚腫瘍学 / 神経線維腫 / 病態医化学 / 皮膚病理 / 病理学 / 皮膚腫瘍 / プロテオーム / 細胞内情報伝達 / 神経系維腫症 / プロテオミクス

【研究成果の概要】

神経線維腫症患者から得られた病理標本を用い、神経線維腫の腫瘍部周辺の正常組織と腫瘍部組織から蛋白質試料を抽出し蛍光色素で標識した後、同一ゲル上で1次元、2次元の電気泳動を行い、蛍光強度を比較検討した。腫瘍部と正常部の泳動結果の比較により、一方のみに発現有意を示す蛋白質スポットの同定を行った。同定された分子のみでは、臨床診断や症状との統一的な説明は困難であった。むしろ、組織差より個人差由来とも考えられ、判断に苦慮する結果となった。同定された因子をさらに詳しく生理的意義を考えて解析して行く必要がある。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】19390281 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ネフローゼ症候群 / 蛋白尿 / プロテオミクス / 腎臓 / 糸球体上皮細胞 / Nephrin / TRPC6 / MYN9 / Epstein-Fechtner症候群 / プロテオーム / ネフローゼ / 細胞内情報伝達 / ネフリン / ポドサイト

【研究成果の概要】

小児期発症の腎疾患の代表的存在であるネフローゼ症候群は、糸球体血管係蹄に存在する蛋白濾過障壁の破綻により発症する。近年、podocyte(糸球体上皮細胞)およびpodocyteを連結するslit膜が蛋白尿濾過障壁の実体であることが明らかになってきた。特に腎特異的発現分子であるnephrinがslit膜の機能と構造維持に中心的役割を担う。本研究において私共はnephrinやNeph1などのスリット膜複合体の構造をプロテオミクスの手段を用いて網羅的に解析した。その結果、スリット膜複合体がリン酸化を介したダイナミックな構造であること、この構造が細胞内シグナル伝達系を司るプラットフォームとして働きそのシグナル伝達が蛋白尿とネフローゼ症候群の発症と深く関連することが明らかになった。また、ネフローゼ症候群や巣状糸球体硬化症を起こす遺伝子変異について解析を行い、Epstein-Fechtner症候群においてMYH9遺伝子のR702変異が糸球体硬化のフェノタイプと最も相関する変異であることを見いだした。これらの結果は糸球体上皮細胞の機能分子がネフローゼ症候群を惹起するメカニズムを明らかにするものである。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】食品科学

【研究領域課題番号】18380077 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNAマイクロアレイ / カロリー制限 / タンパク質栄養 / データベース / ニュートリゲノミクス / トランスクリプトミクス / プロテオミクス / 高脂肪食 / 食品機能 / タシパク質栄養 / 皮膚 / アミノ酸 / トランスクリプトーム / プロテオーム / カルニチン / 食の安全性

【研究成果の概要】

様々なタンパク質栄養条件に応答した肝臓や皮膚での遺伝子発現の網羅的応答を幅広く明らかにした。それらのデータを有効に解析するためのバイオインフォマティクス手法を高度活用し、栄養研究における情報の有効利用を推進した。また、高脂肪食摂食や運動、抗肥満食品因子、マイルドなカロリー制限等に対する網羅的遺伝子発現やタンパク質量の応答に関する情報を蓄積した。従来から構築して維持しているニュートリゲノミクスデータベースを大幅に改良し、世界のニュートリゲノミクス研究を格段に発展させる礎を築いた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】17,320千円 (直接経費: 14,800千円、間接経費: 2,520千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】13559007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオミクス / プロテオーム / マイクロアレイ / プロテインチップ / 蛍光ラベル / 相互作用 / ピューロマイシン

【研究成果の概要】

本研究は,(1)タンパク質のC末端ラベル化,(2)タンパク質のマイクロアレイ化,(3)タンパク質間相互作用の解析という手順で行う。前年度は,これら各ステップについての基盤技術を,Fos-Junをモデルタンパク質としてほぼ確立できたので,本年度は,ラベル化およびマイクロアレイ化のハイスループット化を図るために,他のタンパク質について種類を増やして条件検討を行った.
まず,ポリコーム遺伝子群の中からRYBPおよびRipg1A,カルモジュリン結合タンパク質の中からミオシン軽鎖キナーゼ,カルシニューリン,カルスペルミンなどの遺伝子をクローニングし,GST融合タンパク質として小麦胚芽由来無細胞タンパク質合成系で同時に平行してタンパク質を合成し,グルタチオンを塗布したスライドガラスに固定化した.この上に,蛍光色素Cy3とピューロマイシンが連結した化合物でC末端標識したRYBP, Ring1Aおよびカルモジュリンを振りかけ吸着・洗浄した後,蛍光スキャナーよってタンパク質間相互作用を検出することに成功した.このとき,様々な条件検討の結果,固定化するタンパク質の量は0.1mg/mlの濃度があれば未精製でも十分であり,また,固定化した後1週間経過してもスポットを検出することができたことから,スライドガラス上でタンパク質が安定に保存されることが分かった.
さらに,96穴および384穴マイクロプレートを用いたハイスループット化のモデル実験を行った.ストレプトアビジンにペプチドを付加した融合タンパク質を96穴および384穴マイクロプレートで多数,無細胞転写・翻訳し,ビオチンを塗布したスライドガラス上にスポットした.ペプチドに対する抗体および蛍光標識二次抗体を用いて,各スポットのペプチドを検出することに成功した.今後,ヒト完全長cDNAを用いて,タンパク質マイクロアレイの作成を行う予定である.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)