【研究領域課題番号】20K06537 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / アミノアシルtRNA合成酵素 / 生体分子 / 機能 / 制御機構 / トリプトファン / 免疫寛容

【研究成果の概要】

アミノアシルtRNA合成酵素はtRNAにアミノ酸を結合させるアミノアシル化反応を触媒する酵素である。我々は、ヒトのトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)がこの触媒機能に加え、細胞外に分泌された後、血管新生抑制因子として働くことを発見した。また、最近、ヒトTrpRSがインターフェロン-γ（IFN-γ）に応答して発現量が著しく増加し、細胞内から細胞外に分泌され、免疫寛容に関わる細胞外から細胞内へのトリプトファン(Trp) に対する高い親和性と高い選択性を有する高感度なTrp輸送に関わることを発見した。本研究課題では、我々が最近発見したTrpRSを介した高感度なTrp輸送機構を分子レベルで解明することを目指している。癌細胞では、Trpを代謝する酵素が高発現しており、癌周辺のTrpを枯渇させることでT細胞の増殖を抑え免疫寛容が生じることが明らかになっている。これまでに、Trp代謝酵素により誘導されるTrp欠乏状態が細胞外のヒトTrpRS蛋白質による高感度Trp輸送を著しく促進させることを明らかにした。今年度は、Trp欠乏培地中で、ヒトTrpRSを過剰発現させた細胞と通常細胞とを培養し細胞内への高感度Trp輸送を比較解析することにより、TrpRS蛋白質発現がTrp欠乏状態での高感度Trp輸送に直接関与していることを実証した。また、部位特異的アミノ酸置換TrpRSを用いて解析することにより、Trp欠乏状態での高感度Trp輸送にはTrpRSのトリプトファニルAMP形成能が重要であり、tRNAへのアミノアシル化能は重要ではないことも明らかにした。さらに、IFN-γによる高感度Trp輸送の増加にヘム合成が必須であることも明らかにした。今後、Trp欠乏状態により発現量が増加し細胞膜上でTrpRSと相互作用する分子の特定に挑む予定である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】17K07448 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 転写制御 / 分子認識 / GRASファミリー / 結晶構造解析 / IDDファミリー / 転写因子 / タンパク質間相互作用 / パターン形成 / 蛋白質 / 生体分子 / シグナル伝達 / 植物 / 発現制御

【研究成果の概要】

植物の根の形態形成に関与するGRASファミリーと転写因子IDDファミリーの相互作用に着目して、構造生物学的・生化学的手法を用いてより詳細な転写制御の分子機構の解析を行った。GRASファミリーのSCL3とIDDファミリー複合体のX線結晶構造解析を行った結果、既存のGRAS-IDD相互作用とは異なる新規の相互作用であることが明らかとなった。また、生化学的な解析から転写因子IDDファミリーとGRASタンパク質の組み合わせによって多数のタンパク質から構成される複合体が形成され、複雑な転写制御が行われている可能性が示唆された。

【研究の社会的意義】

植物の根の形態形成は成長過程と調和して転写制御をオン・オフにするため、複雑に制御されている。本研究では根の形態形成に重要な2つのファミリーGRAS, IDDファミリーについてその立体構造解析と分子相互作用解析の結果から、GRASファミリーとIDDファミリーの相互作用様式には多様性があることを示し、結合する組み合わせによって様々な転写制御複合体を形成し得ることを明らかにした。本成果は植物の複雑な転写制御機構の理解を深めると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】17K07329 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 蛋白質間相互作用 / 蛋白質工学 / 酸化ストレス / 細胞保護 / 生体分子 / シグナル伝達 / ストレス

【研究成果の概要】

ヒト脳神経細胞内に存在するニューログロビン(Ngb)は、酸化ストレスに伴う神経細胞死を防ぎ、また、通常酸素濃度正常状態では神経突起伸長を促す。本研究では、我々は、蛋白質工学的手法を用いて、ヒトNgbの作用機序の解明、及び、蛋白質間相互作用に着目した機能制御機構の解明に挑んだ。その結果、Ngbの働きに重要なアミノ酸残基や蛋白質間相互作用に重要なアミノ酸残基を明らかにできた。さらに、今回、新たに、Ngbと相互作用する蛋白質を発見することもできた。

【研究の社会的意義】

本研究により、脳卒中、脳梗塞など酸化ストレスに伴う神経細胞死を防ぎ、さらに神経再生を促す蛋白質であるニューログロビン(Ngb)の作用メカニズムがより詳細に明らかになった。また、Ngbが関わる蛋白質―蛋白質間相互作用についてもアミノ酸レベルで理解できるようになった。これらの研究成果は、脳卒中や脳梗塞のみならず、酸化ストレスに伴う他の疾患である癌、心筋梗塞、神経変性疾患などの治療薬開発にも役立つものと期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】生物物理・化学物理・ソフトマターの物理

【研究領域課題番号】17H04854 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体分子 / 機能的構造変化 / 水和構造 / 溶媒和自由エネルギー / 分子動力学シミュレーション / 溶液散乱実験 / ベイズ統計 / 蛋白質 / 構造アンサンブル / 自由エネルギー地形 / MDシミュレーション / 溶液X線散乱 / 生体分子の機能発揮機構 / X線回折散乱実験 / 蛋白質分子 / 蛋白質ダイナミックス / X線散乱回折実験

【研究成果の概要】

本研究の目的は、「蛋白質の構造変化過程における水和構造の役割の解明」である。この目的のためには、蛋白質の溶液中における構造アンサンブルを可視化し、そのアンサンブルの形成におけるすわい構造の自由エネルギー寄与を明らかにする必要がある。そのために、(1)実験とMDシミュレーションの統合的手法による蛋白質構造アンサンブル可視化法の開発を行い、さらに、(2)蛋白質構造変化に伴う溶媒和自由エネルギー変化の解析方法を開発した。これらの手法により、蛋白質の機能的構造変化の駆動メカニズムを説明するためには、水和構造によるエネルギー的寄与が必須であることが明らかになりつつある。

【研究の社会的意義】

生命の営みには『水』の存在が不可欠であるが、その大きな要因としては、生命活動の素過程を担うタンパク質や核酸といった生体分子が機能するためには、水環境が必須であることが挙げられる。では、なぜ生体分子は機能発現に水環境を必要とするのか？この疑問に答えるためには、生体分子近傍の水和構造を詳しく調べ、その構造を基に、生体分子の構造変化過程といった機能発揮過程において水が果たしている役割を熱力学的に明らかにする必要がある。本研究において開発された構造変化の解析方法は、このような熱力学的研究を可能にし、水和構造の役割を明らかにしつつある。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】25,740千円 (直接経費: 19,800千円、間接経費: 5,940千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】17H03975 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオ医薬 / 抗体医薬 / 安定性 / 凝集 / タンパク質 / 界面 / 免疫原性 / 分析 / バイオ医薬品 / 蛋白質 / 凝集体 / 質量分析 / 立体構造 / 抗体 / 免疫複合体 / TNF / 超遠心分析 / 沈降速度法 / 生体分子 / 薬学 / シグナル伝達 / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

本研究によりバイオ医薬品で発生するタンパク質凝集体の定量的解析手法が確立し、凝集の原因となるストレスの特定に成功し、さらに凝集体の免疫原性との関連性について解明することができた。とくに、プレフィルドシリンジに塗布されたシリコンオイルとタンパク質が複合体となった際の免疫原性への影響は顕著であり、製剤における容器設計の重要性がより明確となった。また、従来から提唱されてきた、コロイド安定性と構造安定性に加えて、界面安定性の向上が凝集体発生の抑制には需要であることを示すことができた。さらに今回見出した振動や衝撃がタンパク質凝集を引き起こす点も医薬品の安定性を高める上で非常に有益であるといえる。

【研究の社会的意義】

本研究は、近年、利用されているバイオ医薬品の安定性と安全性に関するものであるが、これまで不明点が多かったタンパク質凝集体と副作用の関係を実験的に示唆することができた社会的意義の大きい研究成果である。特に、製薬企業から医療現場で利用される実際の場面へとフィードバックが可能な知見が数多く含まれており、かつ、応急処置的な対応では無く、包括的かつ根本的に医薬品の安定性を高めることが可能となることから、科学的意義は当然ながら、産業的意義が大きいといえる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,380千円 (直接経費: 12,600千円、間接経費: 3,780千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】16H03287 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

化学合成 / 生体分子 / 蛋白質 / 糖鎖 / 生体内合成化学治療

【研究成果の概要】

体内の狙った臓器で選択的に金属触媒反応を起こすには、二つの問題を解決しなければならない。一つ目は、どのように体内で不安定な金属触媒を短時間で臓器に運ぶかという問題である。二つ目は、体内にさまざまな分子が存在する中で、どのような金属触媒反応を選択的に進行させるかという問題である。報告者らは、アルブミン糖鎖クラスターを「遷移金属触媒の運び屋」として活用することにより、哺乳動物内での金属触媒反応に初めて成功した。マウス内の望む臓器で選択的に金属触媒反応を行うとともに、蛍光標識や分子の「現地合成」を実現した。

【研究の社会的意義】

報告者らが開発した方法を用いて狙った臓器で選択的に金属触媒反応を起こせば、がんなどの疾患部位で、直接、薬などの生理活性分子を合成できると期待できる。さまざまな金属触媒反応に展開できると考えられ、体内で薬の合成が可能となる。その結果、薬が疾患部位以外で作用して起きる副作用の問題、あるいはペプチドなど不安定な薬の体内での安定性の問題を解決できると期待できる。過去、ドロップアウトしてきた薬理活性分子を生体内で直接見直す新戦略であり、創薬化学やプロドラッグ、あるいはドラッグデリバリーシステムにおける「分子機能のルネッサンス」となる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】18,980千円 (直接経費: 14,600千円、間接経費: 4,380千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】16H06168 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

中心体 / 中心小体 / 細胞分裂 / 細胞生物学 / 遺伝子 / 癌 / 生体分子 / 蛋白質

【研究成果の概要】

本研究では、中心体複製における重要なプロセスである中心小体構築の分子機構に主眼を置き、その初期過程において微小空間で働く分子の機能解析を行った。その結果、初期過程で構築される土台構造であるカートホイールが形成される意義の一端を明らかにした。さらに中心小体周辺のマトリックス構造が形成される為に必要な分子複合体の同定に成功し、その複合体によって分裂期におけるマトリックスの拡大と中心小体間の結合が制御されることを明らかにした。

【研究の社会的意義】

本研究では、新しいタンパク質分解システムを導入することで、中心小体の基底部であるカートホイール構造の生理的な役割を包括的に明らかにした。また、中心小体と周囲のマトリックスの相互関係を明らかにすることができた。このような意味で本研究は方法論的にも新しい概念的にも当該分野に対する波及効果は高いものと期待している。また、本研究で解析した因子は小頭症を含む遺伝子疾患の原因遺伝子としても知られていることから、基礎生物学のみならず医学的にも重要な知見である。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】23,660千円 (直接経費: 18,200千円、間接経費: 5,460千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】16H04580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質工学 / 腫瘍免疫学 / 化学修飾 / バイオテクノロジー / コンパニオン診断薬 / がん免疫治療 / 個別化医療 / 生物工学 / 診断薬 / バイオマーカー / がん抗原 / 抗体検査 / 腫瘍免疫応答 / 蛋白質 / 癌 / 免疫学 / 生体分子

【研究成果の概要】

末梢血に含まれるがん抗原に対する自己抗体をバイオマーカーとして、個人差が大きいがんに対する免疫応答を的確に予測・モニタリングする技術開発に取り組んだ。150種類超の全長ヒトがん抗原の生産リソースを整備し、水溶性で全エピトープを露出するS-カチオン化抗原とluminex法を組み合わせた診断薬プロトタイプを完成した。実際にがん免疫サイクルの活性化を反映する自己抗体の変動を鋭敏に観察することに成功した。

【研究の社会的意義】

変性状態のタンパク質を可溶化する独自開発技術をベースとして、がん免疫治療をサポートできる診断薬開発が進捗した。腫瘍免疫応答は個人差が大きく現状では予測・評価が困難である。本研究で開発した自己抗体定量システムは、ごく微量の末梢血でがん免疫サイクルの活性化レベルを定量評価でき、治療方針の選択に活用できる可能性がある。本研究成果をベースに診断薬の実用化を加速したい。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】16K15212 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

非コードRNA / 蛋白質 / 機能性RNA / 核酸 / 細胞 / 生体分子 / バイオテクノロジー / プロテオーム

【研究成果の概要】

近年、miRNAやlncRNA等に代表されるノンコーディング(nc)RNAが、細胞内で核酸や蛋白質と相互作用して、多彩な生命機能の制御に寄与すること、また、その異常が疾病発症に関与することが明らかにされ、注目を集めている。しかし、個々のncRNAの機能に関しては依然として不明な点が多い。本研究では、ncRNAの機能解析に資する新たな基盤技術の確立を目指して、生細胞内でncRNAと特異的に結合する分子を網羅的に同定する実験法の開発に挑戦し、新規システムを樹立することに成功した。本法はncRNAに限らずmRNAの解析にも広く適用可能であると考えられ、当該分野の発展に大きく貢献することが期待される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】15K07041 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Greatwall / Gwl / M期 / 染色体 / ゲノム / タンパク質 / 生理活性 / 生体分子 / 蛋白質

【研究成果の概要】

細胞分裂周期のM期は複数のM期キナーゼにより制御されている。その中のひとつであるGreatwall（Gwl）キナーゼは、生存に必須であり、M期の開始と進行を制御する。M期開始は、Arpp19/Ensaを標的としてリン酸化し、これがB55型PP2Aフォスファターゼ活性を抑制することで制御する。しかしM期進行の制御については、リン酸化の標的など制御機構は不明である。本研究では、代表者等がこれまでに見いだした15個の基質候補のうち、染色体と相互作用が示唆される一つに着目して解析を行い、これがGwlの新規基質であり、M期進行時に染色体分離を制御する可能性を示した。

【研究の社会的意義】

Gwlによる細胞周期のM期開始制御は解析が進んでいたが、GwlによるM期進行制御は不明であった。本研究の学術的意義は、M期進行を制御する基質候補を初めて見いだした点である。細胞内での役割の詳細はさらなる解析が必要であるが、染色体と相互作用する因子を直接リン酸化し、これが染色体分離制御に関わることが示唆された。Gwlのヒト相同遺伝子はMASTLと呼ばれ、この遺伝子がないと致死であり、点変異により血小板が減少する臨床的知見がある。また染色体分離異常は、染色体数の異常やがん化の原因となる。社会的意義として、こうした異常を引き起こすメカニズムの基礎的な知見が得られたと言える。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-04-01 - 2019-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】連携探索型数理科学

【研究領域課題番号】15KT0103 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分子動力学シミュレーション / 分子生物学 / 数理科学 / 計算幾何学 / 時系列解析 / 分子シミュレーション / ダイナミクス変化 / 分子動力学 / タンパク質 / 分子ダイナミクス / 生体分子 / 分子設計 / エントロピー / 計算幾何 / 構造解析 / タンパク質-リガンド相互作用 / 解析理論

【研究成果の概要】

計算機が進歩したことで、近年、生体分子の分子動力学シミュレーションを大規模におこなうことができるようになった。本研究では、分子動力学シミュレーションから数理科学的手法でダイナミクスの様々な特徴を抽出する手法を考案した。例えば、skeletal coreの概念を使うことで、解析の中で見かけの運動が現れてしまう効果を抑えることができるようになった。また、特異スペクトル変換法をおこなうことで運動の変化を簡単に自動検知できるようになった。

【研究の社会的意義】

本研究は、最近の発展が目覚ましい分子動力学シミュレーションと数理科学的解析との融合を狙ったものである。実際に、skeletal coreや特異スペクトル変換の技術はこれまで検知できなかった生体分子の特徴を取り出すことに成功している。数理科学的手法で新たに解析できるようになった生体分子の特徴は、今後、生体分子の機能を解析したり医薬品を設計したりする基盤として役立つと考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-07-10 - 2020-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】26289310 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / ナノ粒子 / DDS / 抗がん / 生体機能材料 / バイオテクノロジー / 生体分子 / ナノバイオ / 生体機能利用 / 蛋白質

【研究成果の概要】

疎水性温度応答性ポリペプチドとポリアスパラギン酸の融合タンパク質が、加温により直径30 nm程度の均一なナノスフィアを形成することが明らかとなった。このナノスフィアは、分子設計により表面に任意の機能タンパク質を提示することが可能であり、内部は疎水性コアを形成するため、疎水性化合物を容易に内包することができる。これを利用してがん細胞への特異的送達を行うため、表面に分子認識機能を有する分子を提示し、内部には抗がん剤を包含したタンパク質ナノスフィアを構築した。これらタンパク質ナノスフィアは、がん細胞を特異的に認識することができ、がん細胞に到達後は内部の薬剤を放出し殺傷できることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2018-03-31

【配分額】15,990千円 (直接経費: 12,300千円、間接経費: 3,690千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】24227005 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

走査プローブ顕微鏡 / 1分子計測・操作 / バイオイメージング / タンパク質 / 細胞 / ダイナミクス / AFM / 走査型イオン伝導顕微鏡 / 構造生物 / １分子計測・操作 / 1分子計測 / 生物物理 / ナノバイオ / 生体分子 / 原子間力顕微鏡 / 高速AFM / イメージング / 細胞内オルガネラ / 機能動態

【研究成果の概要】

三つの課題に取り組んだ。課題1では、既に確立した高速AFMを利用して多様な蛋白質系で起こる動的プロセスを観察し、機能メカニズムに迫るとともに、従来技術では困難な天然変性蛋白質の構造解析が高速AFMで可能であることを実証した。課題2では、振動を起こさずに広域を高速走査する技術やイメージング中に試料を操作可能なインターラクティブ高速AFMを開発し、その有効性を実証した。また、カンチレバー走査方式の高速AFMと蛍光顕微鏡との複合機を開発し、蛍光像と高速AFM像の同時取得を実現した。課題3では、非接触観察可能な走査型イオン伝導顕微鏡の高速化に向け要素技術を開発し、約100倍の高速化に成功した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2012-05-31 - 2017-03-31

【配分額】215,540千円 (直接経費: 165,800千円、間接経費: 49,740千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】24227004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / チャネル / トランスポーター / 遺伝学 / 電気生理学 / 膜輸送体 / リポソーム解析 / 計算機シミュレーション / 遺伝学解析 / パッチクランプ / 高分子構造・物性 / X線 / 生体分子 / タンパク質 / 薬理学

【研究成果の概要】

イオンチャネルに関しては，新規に同定したMg2+チャネルMgtE，TRICチャネル，P2Xチャネルに関して高分解能の結晶構造に基づき，基質認識機構，輸送制御機構を解明した.トランスポーターに関しては，Ca2+/H+交換輸送体CAX，Fe2+排出輸送体FPN，糖の排出輸送体SWEET，ペプチド輸送体POT，アミノ酸排出輸送体YddG，多剤排出輸送体MATE，膜蛋白質の膜組み込みに働くYidCの高分解能構造を決定し，基質認識機構，輸送機構を解明した.また，チャネルロドプシン，光駆動型Na+ポンプKR2の高分解能構造を決定し，光による輸送駆動機構を解明した.

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2012-05-31 - 2017-03-31

【配分額】217,880千円 (直接経費: 167,600千円、間接経費: 50,280千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】23750182 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 細胞・組織 / 生体分子 / 1 分子計測(SMI) / 生体関連化学 / 機能性分子 / 光制御 / 1分子イメージング / シグナル伝達 / 蛋白質 / 1分子計測（SMD）

【研究成果の概要】

本研究では、細胞内シグナル伝達における受容体クラスター形成の意義の理解を目的とした。この目的のため、シグナル伝達分子Aktの1分子動態観察と、受容体ナノクラスターの人工的形成法の開発を行った。前者では、細胞外からのシグナル入力により、Aktの細胞膜滞在時間が延びることを見出した。この結果は、Akt動態が細胞表面の受容体クラスターに影響されることを示している。後者では、光感応性タンパク質を融合した受容体および精製タンパク質の構築に成功し、クラスター形成の光制御を実現する道具の準備を整えた。以上のように、本研究では受容体クラスターがシグナル伝達に重要な機能を果たしていることを示し、その重要性を構成的に証明する礎を築いた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】23229001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 遺伝子 / シグナル伝達 / Ｇタンパク質 / 小胞輸送 / 栄養センシング / 生体分子 / Ｇサイクル / Ｇ蛋白質 / G蛋白質 / Gサイクル / ゲノムプロジェクト

【研究成果の概要】

Ｇ蛋白質は、GDP/GTP結合型のコンホメーション転換（Ｇサイクル）により、細胞の様々なシグナル伝達系で分子スイッチとしての役割を果たしている。本基盤研究(S)では、これまでに解析の進んだ刺激依存活性化型とは異なる、特異な生化学的特性や構造を有する新奇のＧ蛋白質群を対象に、それらの存在様式・作動原理を細胞レベルから個体レベルに至るまで広範な階層で解析した。これらの新奇Ｇ蛋白質群のＧサイクルは、リソソームの形成・成熟やエンドサイトーシス・エキソサイトーシスといった細胞内小胞輸送経路で機能していることを新たに見出し，Ｇ蛋白質が果たす生理的役割の拡大に貢献した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2011-04-01 - 2016-03-31

【配分額】225,810千円 (直接経費: 173,700千円、間接経費: 52,110千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】22687014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 蛋白質 / 発現制御 / 生体分子 / 遺伝子

【研究成果の概要】

siRNAやmicroRNAなどの小分子RNAは、Argonauteと呼ばれるタンパク質とRISCと呼ばれるエフェクター複合体を形成して機能する。本研究では、小分子RNA二本鎖をArgonauteに取り込まれる際に、Hsc70/Hsp90を中心とするシャペロンマシナリーの働きが必須であることを示し、さらに、シャペロンを含む7つの因子によってRISCの形成過程を試験管内で再構成することに成功した。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】24,700千円 (直接経費: 19,000千円、間接経費: 5,700千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】22247031 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分裂 / 細胞質分裂 / 収縮環 / アクチン / ミオシン / 細胞 / タンパク質 / 微細構造 / 生体分子 / シグナル伝達 / 電子顕微鏡 / 細胞周期 / 細胞運動

【研究成果の概要】

細胞質分裂は収縮環の収縮によって細胞が中央部からくびり切れることによりおこる。私は分裂酵母の収縮環ー細胞膜複合体（細胞ゴースト）を単離し、ATPを加えて収縮環を人為的に収縮させることに初めて成功した。この実験系を用い、アクチンの脱重合は収縮そのものには必須ではないことなどいくつかの性質を明らかにできた。また収縮環形成の際のアクチンの分裂位置への集合にはミオシンVが関与していることが示唆された。ウニ卵の分裂溝にアクチン重合を促進するuDiaがアクチンと共存することも示した。さらにカエル卵抽出液を人工脂質膜に封入することにより、脂質膜小胞中でアクチンの流れが起こることを見いだした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010-04-01 - 2015-03-31

【配分額】39,910千円 (直接経費: 30,700千円、間接経費: 9,210千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】21510229 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞・組織 / 生理活性 / 蛋白質 / シグナル伝達 / 生体分子

【研究成果の概要】

低分量基底膜蛋白質であるAZ-1は、血管基底膜の構成因子として構造的細胞外マトリックス蛋白質、血管内皮増殖因子、同受容体、インテグリン群との結合能を持つ多価相互作用因子であることが判明した。この相互作用が血管内皮細胞の接着、増殖、管腔形成などを制御することにより、血管内皮増殖因子による細胞の活性化が抑制されて血管内皮の恒常性が維持されうることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】生理学一般

【研究領域課題番号】21790197 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

開口放出 / ミオシン2 / マイクロRNA / ホルモン / 神経内分泌細胞 / バイオイメージング / 細胞骨格 / 分泌顆粒 / 可視化 / 生体分子 / 生理学 / 蛋白質 / 神経・脳

【研究成果の概要】

私達は環境変化に対応するため、ホルモンを分泌することにより体内の恒常性を一定に保っている。この機構の破綻は、アレルギー、糖尿病等の種々の疾患に直結する。本研究では、ホルモン分泌制御を行うタンパク質(ミオシン2)を同定し、その機能を生化学・生理学・バイオイメージングなど様々なアプローチで解析することにより、ホルモン分泌の仕組みを分子レベルで理解することが可能となった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】21659351 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオーム / 蛋白質 / 生体分子

【研究成果の概要】

骨粗鬆症などの代謝性骨疾患発症メカニズムの分子レベルでの解明と治療薬の開発を目指し、破骨細胞分化のメカニズムをタンパク質レベルで解明することを研究目的とした。とくにタンパク質のリン酸化、脱リン酸化は細胞内シグナル伝達において極めて重要な反応であり、これらのリン酸化シグナル伝達機構の網羅的解析は分化のメカニズムの全貌を知る上で必須である。リン酸化シグナル経路で制御される重要なタンパク質をプロテオーム解析法により同定し、その機能解析を行うことを目標とした。
昨年度に引き続き、リン酸化シグナル伝達機構に関与する分子を広範囲から同定するために異なる実験手法を用いてスクリーニングを行った。マウス破骨細胞前駆細胞(マウス骨髄マクロファージ)を可溶性破骨細胞分化因子((sRANKL)により刺激後24時間、48時間、72時間のものとコントロール細胞(0時間)をそれぞれ準備し、その細胞溶解液を調製した。各溶解液を用いて、コントロール細胞との比較によるディファレンシャルディスプレー法を2次元電気泳動法とMALDI-TOF MSの組み合わせおよびLC/MSにより行った。その結果、経時変化に伴い顕著に発現量が変化するタンパク質をいくつか同定することができた。これらの結果とすでに得られているトランスクリプトーム解析の結果を比較、検討した。プロテオーム解析とトランスクリプトーム解析の結果は必ずしも一致しておらず、その中にはリン酸化をはじめとするタンパク質の翻訳後修飾由来の変化を示唆する結果も含まれていた。今後、昨年度および今年度のスクリーニングの結果から対象となる分子のノックダウン実験等を試み、破骨細胞分化における影響を明らかにする。リン酸化シグナル伝達に関与すると思われる分子についてはリン酸化部位の同定を行い、リン酸化およびタンパク質の発現に関して、破骨細胞分化への影響を検討する。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】19687011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 蛋白質 / 発現制御 / 生体分子 / 遺伝子 / microRNA / Argonaute / RISC / 小分子RNA / small RNA / miRNA / siRNA / 翻訳抑制 / ショウジョウバエ

【研究成果の概要】

我々は、ショウジョウバエAgo1はATP依存的なpoly(A)の短縮化に加えて、cap認識後の段階を阻害するのに対し、Ago2はeIF4EとeIF4Gの相互作用を阻害しcap機能を遮断するというように、Ago1とAgo2によるmiRNAを介した翻訳抑制の様式に大きな違いがあることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】24,960千円 (直接経費: 19,200千円、間接経費: 5,760千円)

【研究分野】物理化学

【研究領域課題番号】19685001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分光 / 低温 / タンパク質 / 単一分子分光 / 赤外 / 中赤外 / アミドI / 単一分子 / 一分子計測(SMI) / 化学物理 / 光物性 / 物性実験 / 生物体分子 / 一分子計測(SDM) / 生体分子

【研究成果の概要】

本研究では、これまで誰も成功していなかったタンパク質の中赤外吸収スペクトルの1分子観測に成功した。これまで、中赤外吸収を測定するには、感度が良いとされる顕微赤外分光装置でも、100万個のタンパク質が必要であり、1分子の観測例は無かった。そこで、我々は従来法を改良するのではなく、以下に示す全く新しい光学課程を用いて、これを1分子観測を実現した。数ケルビンでも、タンパク質を結合させた色素の蛍光測定し続けていると、無蛍光状態になる。この時、タンパク質に共鳴する赤外光を入射すると、色素の状態が無蛍光状態から蛍光状態に変化することを発見した。我々はこの光学現象を用いて、タンパク質の赤外吸収スペクトルの1分子観測に成功した。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2007 - 2011

【配分額】24,830千円 (直接経費: 19,100千円、間接経費: 5,730千円)

【研究分野】生理学一般

【研究領域課題番号】18689008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

可視化 / 生体分子 / 生理学 / 蛋白質 / 脳・神経 / 開口放出 / ホルモン分泌 / 全反射蛍光顕微鏡 / イメージング / 小胞輸送 / シナプトタグミン / 分泌顆粒輸送 / 低分子量GTP蛋白質 / Rab / ドッキング

【研究成果の概要】

私達の身体は環境変化に対応するため、ホルモンを分泌することにより体内の恒常性を一定に保っている。この機構の破綻は、アレルギー、糖尿病等の種々の疾患に直結する。しかしホルモン分泌の詳細な分子メカニズムについては解明されていない。そこで、超高感度、超高解像度を持つ蛍光顕微鏡を新規開発し、内分泌細胞から起こるホルモン分泌反応を直接可視化計測することに成功した。そして、ホルモン分泌制御機構の詳細な分子メカニズムの一端を解明した。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】27,690千円 (直接経費: 21,300千円、間接経費: 6,390千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】17360393 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バイオテクノロジー / 生体分子 / 生物・生体工学 / 溶媒・添加剤 / アルギニン / 可溶化 / クロマトグラフィー / 凝集会合形成 / フィロールディング / 製剤 / プロテインマニピュレーション / リフォールディング

【研究成果の概要】

新規な蛋白質可溶化・調製法確立への,アミノ酸とその誘導体導入の具体的展開をさらに強固なものとするために,アルギニンとその誘導体の持つ蛋白質凝集抑制に関する作用機序の解明ならびに凝集体可溶化メカニズムへのアプローチについて,以下の観点から研究を進めた.
L-アルギニンとその誘導体の作用機序の解明:1)密度計を用いた溶解度測定によるL-アルギニン誘導体と各種アミノ酸,ペプチド結合との親和性の測定から,誘導体の性質によって,目的の機能向上が可能になることを示した.2)2種類の蛋白質のL-アルギニン存在下における結晶構造解析から,アルギニンが水和構造安定化に大きく寄与すること,蛋白質の高次構造にその作用機序が強く依存することを示した.
L-アルギニンとその誘導体を用いた蛋白質の可溶化:シグナル伝達系蛋白質数種類について,L-アルギニンとその誘導体を用いて発現した封入体の可溶化を試み,アルギニンの有用性を示すことができた.各種熱量測定からその安定性・機能の記述に成功した。以上の結果から,アルギニンとその誘導体を用いた蛋白質の可溶化法を確立した.
各種Chromatographyへの具体的展開:ゲルろ過(GPC),疎水的相互作用クロマトグラフィー(HIC),イオン交換クロマトグラフィー(IEX),色素親和性クロマトグラフィー(Dye),抗体を中心とした各種親和性クロマトグラフィーにおいて展開溶媒としてのアルギニンの有用性を確固たるものにした.
以上の結果から,アルギニンの持つ特殊な化学構造(グアニジウム基とアミノ酸)をたくみに利用することにより,蛋白質表面構造への作用機序を変化させ,汎用性の高い蛋白質ハンドリングに適用可能であることを示し,解析が困難な蛋白質に対する可溶化・調製システムの基盤を築くことができた.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】16,430千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】17655071 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分析科学 / 生体分子 / 自己組織化 / ナノ材料 / 蛋白質 / ゲル / ゲル電気泳動 / 二分子膜 / 組織化重合 / 重合性界面活性剤 / アクリルアミド

【研究成果の概要】

重合性界面活性剤イタコン酸ドデシルグリセリル(DGI : n-C_<12>H_<25>OCOCH_2C(=CH_2)COOCH_2CH(OH)一CH_20H)は、少量のイオン性界面活性剤の存在下で、サブミクロンの距離を隔てた規則的な二分子膜(ラメラ液晶)を形成し、可視光の回折によって発色するという面白い現象を示す。さらにアクリルアミド(AAm)、メチレンビスアクリルアミドが共存する水溶液中で重合することによって、二分子膜構遥を維持したままアクリルアミドゲル中に固定化できる。この二分子膜固定化ゲルは、世界中で当研究室にしか存在しないユニークな材料である。このユニークなゲルを、ゲル電気泳動基材として応用するのが本研究の目的である。
上記の二分子膜固定化ゲルを基材として使用し、i)陰イオン性色素、ii)水溶性蛋白質、iii)膜蛋白質を対象サンプルとして、電気泳動による分離の検討を行った。比較として、既存の手法であるポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)による分離の実験を、どのサンプルに対しても常に行った。低分子量の色素に対しては、二分子膜固定化ゲルによる電気泳動はPAGEと類似の分離挙動を示すが、移動度がやや遅い傾向が見られた。これは、二分子膜が存在することによって、サンプルの疎水性/親水性的性質が分離に働いた結果であると考えられる。本二分子膜固定化ゲルにおいては、ゲルの網目によるふるい効果以外にも別の分離機構が働いていることになり、興味深い。
水溶性蛋白質の分離においては、二分子膜固定化ゲル中の移動度は常にPAGE中より速かった。この傾向は、固定化される二分子膜濃度が高くなる程顕著であった。この結果から、水溶性蛋白質は二分子膜中に取り込まれることなく、水相のみを移動しているのではないかと考えられる。二分子膜濃度が1.2〜1.6wt%程度で分離能が最もよくなり、2.0%を超えると分離せず、本手法として利用することは不可能であった。
膜蛋白質をサンプルとした場合には、二分子膜固定化ゲル中を蛋白質は殆ど移動出来なかった。これは、膜蛋白質が二分子膜内に強く捕捉されるためではないかと考えられる。水溶性蛋白質の分離挙動との違いに着目すれば、水溶性蛋白質と膜蛋白質を分離する、新しい分離法が提案できたのではないかと思われる。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)