【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】26253023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

炎症 / 再生 / 線維化 / サイトカイン / イメージング / 肝炎 / 胆管 / 肝臓 / 肝障害 / 肝細胞 / 間葉系細胞 / 幹細胞 / 免疫

【研究成果の概要】

種々の病因による肝炎から肝幹／前駆細胞の活性化を介した再生応答を、肝臓構成細胞間の相互作用に着目して解析を行った。炎症により肝前駆細胞の活性化を伴う胆管増生は胆管の増殖を伴うリモデリングであることを細胞系譜解析および肝臓の３次元構造の可視化法により示した。さらに、増殖性の胆管細胞は胆管の末端部に局在すること、増殖を始めた細胞の運命はstochasticに決まることを見いだした。また、肝臓でのサイトカインの過剰発現による新規肝線維化モデルを開発し、線維化誘導機構の一端を明らかにした。IL-4過剰発現により特徴的なNK細胞が出現することを見いだしその性状解析を行った。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】40,820千円 (直接経費: 31,400千円、間接経費: 9,420千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13F03750 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 細胞・組織 / シグナル伝達 / 肝臓 / 発がん / 胆管 / 組織幹細胞 / 再生 / 幹/前駆細胞 / ニッチ / 細胞間相互作用 / シグナル / 線維化 / 肝がん

【研究成果の概要】

重篤な、あるいは、慢性的な障害を受けた肝臓では、未分化性を有する特殊な肝前駆細胞（LPC）が活性化して組織の再生に寄与している。LPCは、肝線維化や肝がん等の病態に関連することが長らく指摘されているものの、その実態や機序は未解明である。本研究課題では、LPCと、これの制御に関わるニッチとの相互作用に注目して、両者の性状・制御機構および肝臓の病態における役割の一端を明らかにすることを目的とした。
前年度までに、脂肪肝・線維化・LPCの誘導（胆管増生）を経て早期に肝がん発症にいたる肝病態モデルマウスを確立した。また、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いて、成体マウス肝臓の肝細胞をはじめとする各種構成細胞に遺伝子導入する系の構築を行った。平成27年度には、これらの実験系と、Cre-loxPシステムを用いた細胞系譜追跡系を組み合わせることで、肝がん細胞の起源・LPCの肝がんへの寄与を解析する実験を行った。その結果、上記肝発がんモデルにおいて形成される腫瘍の大部分は、肝細胞に由来することを明らかにした。一方で、腫瘍形成に先立つ段階において、肝細胞由来のLPCが出現することを示唆するデータも得られた。このような「肝細胞由来のLPC」が肝がんの起源となる可能性について、引き続き詳細な解析を進めている。
また、上述したAAVベクターによる遺伝子導入系を改変することで、マウスの胆管上皮組織での遺伝子操作を可能とする、新たな遺伝子導入系の構築に成功した。その効率および細胞種特異性を、さらに改善するための工夫・検討を行っている。
以上２点の研究成果について、国際誌にて発表するための準備を進めている。

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】17390359 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 血小板 / 肝不全治療 / クッバー細胞 / 再生 / Akt / トロンボポエチン / 抗血小板抗体 / クッパー細胞 / 胚不全治療 / トロンボポチエン / 小板

【研究成果の概要】

本研究は血小板による肝細胞増殖作用に着目し、血小板を用いた全く新しい肝再生促進療法、ならびに肝不全治療法の開発を行うことを目的としている。平成17年度はマウス肝切除モデルを用いて血小板を増加させることにより肝切除後の再生が促進されることを明らかにした。また培養肝細胞と血小板を用いた実験系で、血小板内容に肝細胞増殖促進効果があり、シグナル伝達系としてPI3K/Akt経路が重要であることを明らかにした。平成18年度はマウス過大肝切除モデルを用いて血小板増加群と血小板正常群の肝再生を比較した。血小板正常群に対し血小板増加群では肝再生が促進され、生存率の有意な改善を認めた。血小板内に血小板由来増殖因子PDGF、肝細胞増殖因子HGF、インスリン様増殖因子IGF-1が含まれており、HGFとIGF-1が肝再生に重要であることを明らかにした。また長期保存可能な凍結乾燥血小板製剤の開発をマウス血小板を用いて行った。凍結乾燥血小板は形態や生理活性物質がほぼ新鮮血小板と同様に保たれ、肝細胞増殖促進効果を有していることを確認した。平成19年度の検討では血小板の肝硬変に対する治療効果を検討した。マウス肝硬変モデルを用いて血小板増加群と血小板正常群の肝線維化の程度を比較した。
血小板正常群では著明な肝線維化を引き起こすのに対し、血小板増加群では線維化が抑制された。また血小板が肝線維化を抑制させるメカニズムとして、線維化を引き起こす星細胞を活性化させるTGF-betaを抑制し、線維を溶解するMMP-9を増加させることが考えられた。次にラット肝硬変モデルを用いて肝切除後の再生を検討し、肝硬変状態でも血小板に肝再生促進効果が認められた。このことから血小板は肝硬変の抗線維化と再生に有効な治療法であることが示唆された。今後は血小板製剤を用いた肝疾患治療法の実用化を目指して、臨床研究を行っていく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】15,970千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 570千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12557096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖 / 細胞分化 / サイトカイン / 肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から純化された肝幹細胞画分であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞を回収し、これらのクローナルな培養系を用いて、肝細胞および胆管細胞への分化誘導能を有する新規サイトカインのスクリーニングを行うことを目的として研究を行った。肝幹細胞から胆管細胞への分化誘導能を有する培養上清を得て、さらに、この培養上清の特定分子量分画にc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の増殖抑制活性が限定的に存在することを確認した。この分子量分画から活性タンパク・ペプチドの精製を試みたが、結果として培養液中の血清の存在が困難要因となり精製には至らなかった。一方、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞に与える既知の各種サイトカイン、細胞外マトリックス、転写因子C/EBPsの影響に関するスクリーニング解析により、hepatocyte growth factor(HGF)やC/EBPsが肝幹細胞の初期分化に重要な役割を果たしていることを明らかにした(Development 130:2513-2524,2003)。
今後、肝幹細胞の分化・増殖機構を精度の高い解析系を用いて、ひとつひとつ丹念に検証していくとともに、実用化技術の開発に向けた疾患モデル動物における治療効果についても並行して検討する必要がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】9,800千円 (直接経費: 9,800千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12307023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 肝臓 / 幹細胞 / 再生

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から肝幹/前駆細胞画分であるc-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞を選別・回収する技術を確立した。さらに、肝幹細胞の純化を進め、胎児肝臓中の僅かに0.3%を占めるにすぎないc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定的に肝幹細胞が存在することを明らかにした。そして、このc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞は、多分化能を維持したまま増殖可能で自己複製能を有していること、膵細胞や腸管上皮細胞など他の細胞系列の細胞へ分化する可塑性を有していることなどを明らかにした。これらのc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞が有する特性は、この細胞が厳密に定義し得る多能性肝幹細胞であることを如実に示している。これは、今まで概念としてしか捕らえられていなかった肝幹細胞の実体を初めて明確にしたという点で、幹細胞生物学的に意義の深い研究成果であったといえる。また、応用科学的側面からは肝幹細胞の分離・操作の基盤技術が確立されたといえ、今後の先進医療への応用が期待できる研究成果である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】21,310千円 (直接経費: 19,000千円、間接経費: 2,310千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】11877192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学 / 自己修復能

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。昨年度までの研究により、c-Kit-CD49f+CD29+ CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在し、肝細胞と胆管細胞という異なる細胞系列へと分化し得ることを明らかにした(Hepatology 32(6):1230-1239,2000.)。今年度は、c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞の画分化を段階的にすすめ、自己増殖能をも備えた幹細胞画分を明らかにすることを試みた。その結果、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能、多分化能、自己複製能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)が高頻度に存在することが判明した。また、この肝幹細胞の少なくとも増殖にhepatocyte growth factor(HGF)が必須の因子であることを明らかにした。今後、さらに、純化した肝幹細胞の分化・増殖・自己複製機構を培養系を用いて解析し、「臓器再生」の基盤となる知見および技術を確立する予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】10770579 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 幹細胞 / 分化 / 増殖 / 自己複製 / 肝細胞 / 胆管細胞 / liver / regeneration / organogenesis / stem cell / cell growth / differentiation

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。まず、in vitro肝幹細胞機能解析系の確立を目的として、マウス胎仔肝細胞の培養系を検討し、1個の細胞を始点とするクローン性コロニーを効率よく誘導可能な培養条件を決定した。そして、このコロニー形成能を指標として、FACSとモノクローナル抗体により画分化したマウス胎仔肝から単離した細胞群の解析を行った。その結果、胎仔肝中の非血球画分であるCD45^-TER119^-細胞から段階的に画分化を進め、最終的にc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞中に限定的、かつ、高頻度に増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在することが判明した。さらに、それらのクローン性コロニーを拾い上げRT-PCRおよび免疫染色法による細胞系列マーカーの発現の検討を行った。その結果、肝細胞マーカーと胆管細胞マーカーの発現を共に確認した。すなわち、1個のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞から肝細胞と胆管細胞という異なる系列の細胞が分化し得ることを明確に証明した。また、FACSにより分離したc-Kit^-CD49f^+CD29^+CD45^-TER119^-細胞は、in vivoにおいても肝組織再構築能を有することを細胞移植により確認した。これらの結果は、マウス胎仔肝臓中のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞は、高い増殖能、多分化能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)であることを示唆する。すなわち、本研究により、精度の高い肝幹細胞の純化・回収法が世界に先駆けて初めて確立された。これらの成果に関する論文は、現在投稿中である。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)