Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

再生 / 蝸牛 / 有毛細胞 / 遺伝子治療 / 前庭 / 支持細胞 / RNAi / BrdU

モルモットの蝸牛有毛細胞をエクタクリン酸(50mg/kg内頚静脈に静注)とカナマイシン(400mg/kg筋注)により傷害した。このモデルを用い、傷害4日後にp27siRNAとGFPをコードするアデノウイルスベクター(p27siRNA・GFPAdV)を蝸牛内に投与し、2ヶ月後の内耳における再生の有無を検討した。コントロールには反対側(非投与耳)およびコントロールベクター(random sense siRNA-GFP)投与耳を用いた。
機能については聴性脳幹反応(ABR)によりしらべたところ、p27siRNA・GFPdV投与側でコントロール側に比べ平均20dbの閾値低下が見られた。Surface preparetionおよびその割面の観察によりBrdUとGFPの多重染色を行ったところ、ベクターの感染細胞(GFP陽性細胞)における細胞分裂の存在が見られた。しかし有毛細胞マーカー(myosin VIIa)の多重発現は観察できなかった(今後の検討課題)。微細形態については走査電子顕微鏡により感覚上皮表面の形態をコントロールと比べたところ、境界細胞や柱細胞の表面に未成熟な聴毛が見られ、またもともと有毛細胞存在したscar部位にも聴毛に似た構造が見られた。透過電子顕微鏡により聴毛様構造物の生じた部位の細胞の状態を割面で観察したが、支持細胞が分裂して新たな有毛細胞様細胞が生じたという明らかな証拠は得られなかった。
前庭有毛細胞についてもゲンタシン溶解液(40mg/ml)を0.2ml中耳内に投与して傷害し、1週間後にp27siRNA・GFPAdVを外側半規管に投与した。その結果感覚上皮にGFPの発現は見られ、分裂能の亢進も確認できている。

培養 / 内耳 / 再生 / 遺伝子治療 / 有毛細胞 / Cochlea / hair cell / apoptosis / GDNF / gene therapy

成熟モルモットを麻酔・消毒後、滅菌操作で断頭し、側頭骨を摘出、実態顕微鏡下に蝸牛と前庭に分け、CO2インキュベーターに入れて培養した。その後1日-7日間培養し、固定してsurface preparationおよび透過電顕にて観察した。蝸牛においては培養2-3日以内に有毛細胞は死滅し、支持細胞も変性した。ただし、1-2日目の透過電顕の所見ではscar formationが見られ、一部支持細胞表面に有毛のような構造が見られた。前庭では有毛細胞の変性は蝸牛より遅く7日間の培養でも正常に近く保たれた。蝸牛・前庭どちらにおいても神経線維の脱落が培養初期より認められた。はじめはfree radical scavenger等の投与により有毛細胞死の防御を予定していたが、すでに同様の実験での報告がなされたため、この実験系を用いて遺伝子導入が可能か検討した。LacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターを投与し、その発現を見たところ、蝸牛ではmesothelial cell以外に血管条、ラセン神経節、Deiters cellやpillar cellなどの支持細胞、外有毛細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。前庭では有毛細胞および支持細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。今後は神経賦活因子や再生関連遺伝子を組み込んだベクターの投与を行なう予定である。

【研究分担者】
鈴川圭吾 (鈴川佳吾)	東京大学	医学部・附属病院	助教	(Kakenデータベース)
渡辺健太	東京大学	医学部附属病院	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
肥後隆三郎	東京大学	医学部・附属病院	助手	(Kakenデータベース)
石本晋一	東京大学	医学部・附属病院	助手	(Kakenデータベース)
鈴木光也	東京大学	医学部・附属病院	講師	(Kakenデータベース)