【研究領域課題番号】20H02906 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Aspergillus niger / citric acid production / CRISPR/Cas9 / genome editing / transporters / Aspergillus tubingensis / citric acid / organic acid transport / mitochondria / Aspergillus　tubingensis

【研究成果の概要】

クエン酸高生産糸状菌Aspergillus tubingensis WU-2223Lを供試菌として効率的なゲノム編集技術を確立し（I. Yoshioka, and K. Kirimura, J. Biosci. Bioeng., 131 (6), 579-588 (2021)）、有機酸輸送体遺伝子の機能解析に応用した。ゲノム編集技術を用いて、ミトコンドリアに局在する有機酸輸送体タンパクをコードする遺伝子の機能解析を実施し、クエン酸生産に関与する輸送体遺伝子を特定することに成功した（論文投稿中のため詳細省略）。また、細胞質から細胞外（培養液）へクエン酸を排出するタンパクCEXAについて機能解析を進めた。供試菌はグルコースを炭素源とした場合に2%(v/v)メタノールの培地への添加によってクエン酸生産量が増大する、いわゆるメタノール効果を顕著に示す菌株である。メタノール効果は1940年代に見出されていたが、その本質は不明なままであった。申請者はメタノール効果の1つの標的がCEXAをコードする遺伝子cexAで、この遺伝子を高発現させればメタノール非存在下でもクエン酸生産量が高いクエン酸生産糸状菌が作製できるとの作業仮説を立て、これについて検証した。まず、CEXAをコードする遺伝子cexAのノックアウトによってクエン酸生産能を欠失した株を作製した。つぎに、これを宿主として、ゲノム編集技術によりtef 高発現プロモーターの下流にcexAを配置してcexA高発現株を作製し、クエン酸生産能力を検討した。当該高発現株は、メタノール非存在下でグルコースを炭素源として（親株である）WU-2223L株より高いクエン酸生産量を示した（論文投稿中、数値省略）。すなわち、予想通り「メタノール効果非依存型」のクエン酸生産糸状菌の作製に成功し、約80年前からの謎であったメタノール効果の本質を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】13,520千円 (直接経費: 10,400千円、間接経費: 3,120千円)

【研究領域課題番号】20K17592 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

乳癌 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / CDK4/6阻害剤 / 細胞周期 / サイクリン依存性キナーゼ / Drug screen / CDK4/6 / Resistance / Breast Cancer

【研究成果の概要】

ホルモン受容体陽性乳癌のモデルMCF7を用い、Cas9を導入し、その安定発現と酵素活性を確認した。Whole genome knockout libraryを用いてCRISPR/Cas9によるゲノム編集を行った細胞とCDK4/6阻害剤の一種であるpalbociclibとの共培養を約2週間行った。最終産物の細胞からgDNAを抽出し、各sgRNAに付随するバーコードをPCRで増幅させ、NGSによる解析を行った。現在は解析結果確認中であるが、既報にて確認されているRbのノックアウト株が細胞増殖を認めるなど耐性候補遺伝子同定のアッセイが機能したことを示唆する結果が確認されている。

【研究の社会的意義】

本研究はHR陽性乳癌におけるサイクリン依存性キナーゼ（CDK）4/6阻害剤の耐性遺伝子を同定することを目的とする。近年、内分泌療法とCDK4/6阻害剤の併用が無増悪生存期間の延長を示し、標準治療となった。しかし、薬剤耐性の発現と腫瘍再増大が臨床上の問題となっている。そこで、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術を用いてWhole-genome knockout screenを行うことで耐性遺伝子を網羅的に探索し、癌細胞におけるCDK4/6阻害剤耐性の原理を明らかにする。本研究の手法を用いることで、新規耐性遺伝子を発見し、薬剤耐性克服の一助となる知見を得ることが可能と考えられる。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2020-04-01 - 2022-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究領域課題番号】19K05928 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

iPS細胞 / 小腸オルガノイド / Caco-2細胞 / レンチウイルス / CYP誘導 / スクリーニング / ゲノム編集 / ヒト小腸オルガノイド / CRISPR/Cas9 / オルガノイド / 食品成分 / 分子細胞生物学

【研究成果の概要】

生理機能が高いとされるヒト小腸オルガノイドを用いた解析を行った。サイトカインを恒常的に発現するL細胞の培養上清を使用し，オルガノイド培養のコストの大幅な削減，および高効率な遺伝子導入に成功した。薬物代謝酵素の誘導，糖取り込み，カイロミクロン分泌といったヒト小腸で重要な生理機能は，従来の株化細胞であるCaco-2細胞では低いが，オルガノイドより作製した単層の腸管上皮細胞では高いことが示された。

【研究の社会的意義】

小腸オルガノイドの利用には，手間に加え膨大なコストを要する。本研究では、培養コストを従来よりも1/100に低減させ，さらに実験者誤差が生じにくい操作方法の確立に成功した。また，小腸オルガノイドでは様々な代謝機能が従来の細胞に比べて高いことを具体的に示した。以上の結果は，特に基礎研究におけるオルガノイドの活用を促進し，これまでに見出せていないヒトバイオロジーの解明に大きく貢献することが期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】18K19622 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

glioblastoma / gene therapy / suicide gene / neural stem cell / CD-UPRT / migration / genome-editing / CRISPR/Cas9 / 自殺遺伝子 / iPS / 神経幹細胞 / 遺伝子治療 / 脳腫瘍

【研究成果の概要】

悪性グリオーマは予後不良の脳腫瘍であり、腫瘍幹細胞 (BTSC) はびまん性に浸潤する性質を有する。神経幹細胞(NSC)は、脳腫瘍へ遊走する性質を持ち、治療遺伝子を搭載する運搬体として注目される。本研究では、浸潤性BTSCの根絶を目指して iPS細胞から分化誘導したNSCを用いた自殺遺伝子細胞治療の開発を行った。ゲノム編集技術を利用して、iPS細胞への治療遺伝子yCD-UPRTの挿入部位を最適化し、優れた治療用NSCへ分化誘導することに成功した。その後、BTSCへの治療効果を評価し、顕著な効果を得た。本研究は、ゲノム編集技術と遺伝子細胞療法を組み合わせた革新的治療戦略と考える。

【研究の社会的意義】

BTSCは正常脳組織へ浸潤して発育するため、既存の治療法とは異なる細胞傷害機序を有する新たな治療法の開発が望まれている。本研究の斬新性は、NSCの脳腫瘍へ集積する性質に着目し、iPS細胞から分化誘導されたNSCをBTSC治療のための遺伝子搭載細胞として利用することにある。iPS研究は再生医療への応用が急速に進められているが、脳腫瘍治療への応用はほとんどない。さらに、最新のゲノム編集技術を用いて、自殺遺伝子CD-UPRTをiPS細胞に組み込む点も意義深い。本研究手法は今後の遺伝子治療のプラットフォーム技術となる革新性を有している。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2018-06-29 - 2021-03-31

【配分額】6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)

【研究領域課題番号】18K16947 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

角膜ジストロフィ / ゲノム編集 / 角膜内皮 / Fuchs角膜内皮ジストロフィ / TCF4 / Fuchs角膜変性症 / 角膜内皮細胞 / トリプレットリピート / RNA seq / 全ゲノムシーケンス / Fuchs角膜内皮変性症 / CRISPR/Cas9 / RNAseq / フックス角膜内皮変性症 / RNA-seq

【研究成果の概要】

外来のFuchs角膜内皮変性症患者から採取した41人分のDNAに対してSTR assayおよびRepeat primed PCRを行い、TCF4のリピート伸長は8人(19.5%）に認められた。不死化角膜内皮細胞HCEnCのリピートをCRISPR-Cas9を用いて切断し、リピートノックアウト細胞株の作成に成功した。この細胞株は光学顕微鏡による表現型、細胞増殖曲線、TCF4の遺伝子発現量に違いがなかった。HCEｎCに対して60および80リピートのドナーを用いリピートノックイン細胞株の作成にも成功した。80リピートノックイン細胞株ではRNA凝集、TCF4遺伝子発現の増加がみられた。

【研究の社会的意義】

本課題における検討において、世界で角膜移植の約４０％を占めるFuchs角膜内皮変性症について本邦の症例のDNA解析を行い、TCF4遺伝子のリピート伸長型が一定の比率を占めることを確認できた。また、CRISPR-Cas9を用いて角膜内皮細胞株のリピートのノックアウトおよびノックインに成功し、リピート切断治療の可能性および、リピート伸長によるRNA凝集という細胞内の病態を反映するモデルを作成できた。今後のFuchs角膜内皮変性症の病態解明および治療法の検討にあたり、大変有用なモデル細胞で学術的、社会的意義があると考えられる。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】17H01394 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

実験動物 / ゲノム編集 / ウイルスベクター / CRISPR/Cas9 / 不妊 / CRISPR/cas9 / ES細胞

【研究成果の概要】

CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を申請者が得意とするレンチウイルスベクターやES 細胞などと組み合わせ、任意の遺伝子改変を可能にするオンデマンドゲノム編集システムを開発した。さらに開発した遺伝子組換え技術・動物を用いて、精巣特異的発現遺伝子の機能解析に取り組み、精子形成や精子機能獲得メカニズムを明らかにした。

【研究の社会的意義】

生命科学研究の進展には、個体レベルで遺伝子機能を解析する手法が必要不可欠である。申請者はCRISPR/Cas9ゲノム編集技術を活用して任意の遺伝子改変マウスを作製するツールを開発した。さらに、開発した遺伝子組換え技術を用いて雄性不妊マウスを多数作製し、その原因を明らかにした。本研究成果は、社会問題にもなっている不妊症メカニズム解明と治療法開発に貢献する。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】41,730千円 (直接経費: 32,100千円、間接経費: 9,630千円)

【研究分野】生物有機化学

【研究領域課題番号】16K07722 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イネ / 病害抵抗性 / ファイトアレキシン / サイトカイニン / ジャスモン酸 / シグナル伝達 / ゲノム編集 / 環境保全型病害抵抗性制御技術 / いもち病菌 / イソペンテニル基転位酵素 / CRISPR/Cas9 / 環境調和型農林水産 / 植物の病害抵抗性 / 植物ホルモン

【研究成果の概要】

本研究では、イネの病害抵抗性反応の制御に関与する２種の植物ホルモンであるサイトカイニン(CK)とジャスモン酸(JA)の相互作用を解明することを目的とした。イネにおいて、病原菌感染等のストレスにより誘導されるCK生合成の鍵遺伝子を同定するとともに、JA生合成変異体cpm2を用いたゲノム編集によりCK欠損変異体や CK・JA二重欠損変異体を作製した。さらに、これらの変異体を用いて、イネの病害抵抗性の制御にCKとJAが協調的に作用していることを明らかにした。また、イネにおけるファイトアレキシン生産などの病害抵抗性が暗黒下で抑制されることを示すとともにこの抑制がショ糖の外生投与で回復することも示した。

【研究の社会的意義】

イネにおいて、ファイトアレキシン生産などの病害抵抗性反応の制御にジャスモン酸(JA)やサイトカイニン(CK)などの植物ホルモンが関与することが示唆されていたが、その詳細は不明であった。本研究では、JA生合成変異体であるcpm2を用いたゲノム編集によりCK欠損変異体やCK・JA二重欠損変異体を作製し、それらの変異体を用いて、JAとCKがイネの病害抵抗性の制御において協調的に機能していることを実証した。本研究によって得られた成果は、病害抵抗性の制御機構に新規な知見をもたらしただけでなく、植物ホルモンを用いた環境保全型の新たな病害抵抗性付与技術開発のための基盤となる知見を提供するものと考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】16K15229 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

認知症 / 凝集タンパク質 / CRIPSR/Cas9 / タウ / 脳神経疾患 / CRISPR/Cas9 / 神経変性疾患 / 凝集 / CRIPSR / ゲノム編集

【研究成果の概要】

認知症患者脳における特徴的な病理学的所見の一つである細胞内凝集体は、タウタンパク質を構成成分としている。細胞内におけるタウ凝集体の形成や除去といった細胞内凝集体の動態を規定する分子メカニズムの解明は、治療戦略を考える上で重要と考えられる。本研究では、そのメカニズムに関与する新規分子をCRISPR/Cas9システムを用いたゲノムワイドスクリーニングにより探索することを目指し、その実験系の構築を行った。そして脳に蓄積するタウ凝集体と類似した凝集体を保持する培養細胞系を確立し、その挙動をFACSにより定量的に測定することに成功した。今後ゲノム編集を加え凝集体の量の変化を与える遺伝子の同定を目指す。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】16H05474 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 脱細胞化 / 再細胞化 / CRISPR/CAS9 / ゲノム編集 / 再生医療 / 生殖医療 / 光遺伝学 / 子宮再生 / iPS細胞 / 生殖医学 / 細胞治療 / ティッシュエンジニアリング / CRSPR/CAS9 / 幹細胞 / 遺伝子制御

【研究成果の概要】

齧歯類における脱細胞化子宮内膜組織（DES）を用いた内膜再生技術と光応答性CRISPR/CAS9（光CAS9）による遺伝子編集システムの開発を行った。内膜菲薄化・欠損モデルにおいて、DES移植により腺管構造を有する内膜の再構築が可能であった。その際、正しく再構築されるためには、用いるDESの構造極性が重要であった。一方、光CAS9の遺伝子編集を通じて、in vitroでの遺伝子の発現を抑制・増強できること、さらにin vivo子宮においてもその遺伝子編集により生殖能を任意に制御することが可能であった。両技術の融合による子宮内膜の再生を目指した新しい治療法・研究ツールの基盤知見・技術が得られた。

【研究の社会的意義】

DESと再細胞化技術による子宮内膜組織の再生は、アッシャーマン症候などの内膜菲薄化・欠損患者に対して有用な治療になり得る。一方、反復着床不全による不妊症や不育症の原因となる内膜の機能不全は、光CAS9という時空間的制御可能なゲノム編集システムを用いて遺伝的アプローチからその異常を是正することにより、改善・解決が可能である。本研究の成果は、新しい内膜機能・構造の再生・再建医療の開発につながる点で社会的意義が大きい。さらに、これらの技術を単独あるいは融合させることにより、子宮内膜の機能と構造を担う分子細胞生物学的メカニズムを明らかにする研究手法ツールになり得る点で、学術的意義も高い。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】15K14366 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / マウスES細胞 / ノックイン / CRISPR/Casシステム / 遺伝子組換えマウス / ES細胞 / 点変異

【研究成果の概要】

新たなゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムは、簡便かつ高効率に遺伝子改変動物を作製することができる。本課題では、単純な遺伝子破壊ではなく、点変異やノックインなどのより高度なゲノム編集を試みた。
まず、受精卵注入法で試みたところ、0.1kb以下のノックインは効率良く導入できたが、それ以上のノックインはうまくいかなかった。つまり、受精卵注入法でのノックイン効率は、導入カセットの大きさに依存して低下することが分かった。次に、相同組換え効率が高いマウスES細胞を用いたところ、一本鎖オリゴDNAよりも二本鎖DNAの方がはるかに効率良く、そして両アリルへ目的変異を導入できた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】腫瘍治療学

【研究領域課題番号】15K14404 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CRISPR / Cas9 / ゲノム編集 / がん抗原 / 細胞傷害性T細胞 / Crispr / CRISPR/CAS9 / がん抗原特異的CTL / 抗原特異的な癌免疫細胞療法

【研究成果の概要】

マウスCD8+T細胞に、T細胞受容体を標的として、改良型SpCas9リコンビナントタンパク質/ gRNA複合体を電気穿孔法を用いて細胞内に導入し、TCR欠損CD8+T細胞を作成した。その細胞に、hgp100がん抗原特異的TCR遺伝子を導入し、hgp100がん抗原特異的CTLを作出した。この細胞は、悪性黒色腫に対して高い細胞傷害性を示した。我々は、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いて、TCR遺伝子の除去に成功した。そしてTCR欠損CD8+T細胞にがん抗原特異的TCRsを遺伝子導入することで、がん抗原特異的細胞傷害性T細胞を作成することに成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】獣医学

【研究領域課題番号】26660227 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ウイルス / CRISPR/Cas9 / ゲノム編集

【研究成果の概要】

ウイルスの増殖には宿主細胞の様々な細胞性因子が必須である。本研究では、新規のゲノム編集テクノロジーであるCRISPR/Cas9システムとウイルスベクターを融合させ、ウイルス増殖を制御する細胞性因子の探索を試みた。ランダム標的gRNA/Cas9発現レトロウイルスベクターライブラリーを培養細胞に感染させた後、インフルエンザおよびアカバネウイルスの感染に耐性となる細胞を樹立した。インフルエンザウイルスの新規の増殖関連因子の同定には至らなかったが、アカバネウイルスの細胞への侵入に関与する耐性細胞の解析から、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】26430190 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム編集 / 環境ストレス / イオン輸送体 / ストレス応答 / CRISPR/CAS9

【研究成果の概要】

本研究は、植物の環境応答能向上を目的としてシロイヌナズナ気孔開口に機能するプロトンポンプを標的としてCRISPR/Cas9によるゲノム編集を行った。Cas9を配偶子および茎頂特異的強発現プロモーターで制御した場合、off-target変異の無いbi-allelic 変異が高効率で得られ、新規のシロイヌナズナ変異体を作製した。新規変異体は野生型より高い葉面温度を示し、植物ホルモンアブシジン酸(ABA)に対する気孔の閉鎖能および葉の水分損失速度が高まっていた。以上のことから、CRISPR/Cas9による新規プロトンポンプ変異体は水分ストレス応答が向上していることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】26291010 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

非コードRNA / CRISPR / Cas9 / Argonaute / piRNA / ゲノム編集 / RNA / 結晶構造 / Maelstrom / Crystal structure / Ribonuclease / CRISPR-Cas9

【研究成果の概要】

カイコに由来するPIWIタンパク質（Siwi）を精製し、その結晶構造を世界で初めて解明した。その結果、SiwiがpiRNAと結合して生殖細胞を守る分子機構の一端が明らかになった。さらに、様々な細菌に由来するCas9およびCpf1の結晶構造を解明し、CRISPR-Cas酵素の多様な作動機構の理解に貢献するとともに新たなゲノム編集技術の開発基盤を確立した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2018-03-31

【配分額】16,640千円 (直接経費: 12,800千円、間接経費: 3,840千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】25250014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム編集 / 生殖不全 / 遺伝子破壊 / 点変異 / ES細胞 / ノックイン / CRISPR/Cas9 / 男性避妊薬 / CRISPR/Cas / 実験動物 / ノックアウト / 不妊 / 人工制限酵素 / 遺伝子組換え

【研究成果の概要】

本研究課題では、ZFNやTALENに代わる新しい遺伝子改変技術であるCRISPR/Cas9システムを用いてマウス個体レベルでのゲノム編集技術を確立した。まずpCAG-EGxxFPプラスミドを作製し、EGFP蛍光を指標に培養細胞内でのDNA切断効率を判定する系を確立した。次に、標的配列を認識するgRNAとDNA切断するCAS9酵素を発現するプラスミドを受精卵に注入し、両者を一過性に発現させることで、約半数の子孫で遺伝子破壊マウスを作製できる系を確立した。さらにゲノム編集したES細胞を用いたキメラ解析などが実用的であることを示した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】45,890千円 (直接経費: 35,300千円、間接経費: 10,590千円)