【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】17K15081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヘムタンパク質 / 過渡的複合体 / 結晶構造解析 / 生物無機化学 / 鉄 / グラム陽性菌 / 結晶構造 / ヘム / タンパク質複合体 / 蛋白質 / 微生物

【研究成果の概要】

感染症の原因となる微生物の多くが宿主のヘムを鉄源として利用するために、ヘムをリレーのように輸送して細胞内に取り込むシステムを有している。本研究では、ヘムのリレー輸送の分子機構を解明するために、新規なヘム結合・輸送タンパク質HtaA・HtaBの複合体構造解析に取り組んだ。過渡的な複合体の安定化のために、ヘム結合部位にあるHisをAlaに変異させた変異体を作成して、ヘム結合能の解析と結晶構造解析を行った。HtaAのC末端ドメインのH434A変異体は、結晶中でドメインスワップした二量体を形成していた。本構造はヘムリレー輸送における過渡的な輸送複合体を模倣していると考えられる。

【研究の社会的意義】

感染症の原因となる細菌はヒトの赤血球からヘム鉄を獲得して、鉄源として利用することができる。本研究は、ジフテリアの起炎菌を含むコリネバクテリアにおいてヘム鉄の獲得に利用されるHta/Hmuシステムに着目して、その詳細なヘム鉄輸送機構の解明を目指している。Hta/Hmuシステムの構造情報はジフテリア起炎菌等への特異的な薬剤開発の基盤となりうる。本研究の最終目標である過渡的複合体を介した輸送機構の解明は、生体における物質輸送という生命の根幹を担うシステムの理解につながると考えており、その学術的意義は大きい。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】寄生虫学(含衛生動物学)

【研究領域課題番号】26293093 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

感染症 / 原虫 / 病原機構 / 膜輸送 / 代謝 / 創薬 / オルガネラ / 進化 / 小胞輸送 / プロテアーゼ / 微生物 / 蛋白質 / システインプロテアーゼ / 赤痢アメーバ

【研究成果の概要】

腸管寄生性原虫赤痢アメーバのもつ、組織破壊に重要なシステインプロテアーゼの細胞内輸送・分泌の分子機構を解明することを目的に、リソソームから細胞膜への輸送に関与する低分子量GTPase Rab11Bと相互作用し活性を制御したり、分泌を直接実行する分子の特定を行った。活性型 Rab11B に特異的に結合するタンパク質としてbeta adaptin, gamma adaptin, Sec6を同定した。Rab11B が積み荷輸送において出芽から繋留まで制御することを示唆している．本研究成果は、病原因子の分泌と組織破壊を阻害する方法の構築にも役立つ可能性がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】16,120千円 (直接経費: 12,400千円、間接経費: 3,720千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】19380054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

放射線 / 遺伝子 / 微生物 / タンパク質 / DNA修復

【研究成果の概要】

放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランス由来のDNA修復促進タンパク質PprAについて、1.35Åの分解能での結晶構造解析に成功し、DNA結合に重要なアミノ酸残基の空間配置を明らかにした。また、PprAタンパク質の放射線誘導に関わる新規制御タンパク質PprMを同定し、その作用機序を明らかにした。さらに、デイノコッカス属細菌で使用できる新規プラスミドベクターを開発した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】20,020千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 4,620千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15370065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バクテリオファージ / 分子機械 / 分子認識 / 分子集合 / 感染 / 超遠心分析 / X線結晶構造解析 / 微生物 / 超分子構造 / リゾチーム / テイルリゾチーム / 収縮姓尾部 / 感染機構 / バクテイオファージ / T4ファージ / プロセッシング / 蛋白質工学 / T4類縁ファージ / βヘリックス

【研究成果の概要】

本研究は、バクテリオファージの収縮性尾部を対象として、ナノマシーンとしての尾部の分子集合機構および作動原理を分子・原子レベルで明らかにしようとするものである。3年間の成果のうち、特に重要なものは以下の通りである。
パーデュー大学ロスマン教授のグループとの共同研究により、尾部収縮後の構造が電顕画像からの3次元像再構成によって明らかになった。収縮後の低分解能の電子密度にもこれまでに決定された7つの蛋白質の高分解能構造が無理なくあてはまったことにより、構造変化では個々のサブユニットの構造は大きく変化せず、主に配置変換によってマクロな構造変化が起こっていることが明らかである。さらに、この構造変化の主役を担っているのがgp10で、この蛋白質が長軸に関して回転することにより、それまでgp12(小尾繊維)に結合していたgp11が尾繊維(gp34)に結合することが分かった。
テイルリゾチームgp5はプロセッシングを受けて351残基目のセリンのC端で切断されるがこれをロイシンに置換したgp5は切断が起きないことが分かったので、この変異体を調整して構造決定を行うことが出来た。その結果、これまで明らかでなかった切断部位周辺の15残基の構造が明らかになり、また、隣のサブユニットから出ているペプチドが基質認識部位を占拠することによってリゾチーム活性を抑制している現象は切断の結果ではなく、切断以前に起こっていることが分かった。
T4類縁ファージKVP40のテイルリゾチームgp5の単離・性状解析およびgp27対応蛋白質の発見:テイルリゾチームgp5はリゾチームドメイン・C末端β-helixを含む特異な構造を有し、N末端ドメインでgp27と結合し、gp27を介して基盤と結合している。T4近縁のファージではgp5のドメイン構造は良く保存されているが、遠縁になるに従って類似性が低くなる。KVP40のgp5ではリゾチームが欠損している。このgp5をクローニング、発現、単離して、性状解析を行ったほか、通常のbalst検索では検出されないが、ORF334を候補と考えてクローニング・単離・精製を行ったところ、この蛋白質がgp5と強く結合することが確認された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】環境動態解析

【研究領域課題番号】08458142 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

海洋 / 溶存有機物 / 細菌 / タンパク質 / 炭素低環 / 加水分解酵素 / 温室効果 / 分解 / 炭素循環 / 微生物 / アミノ酸 / 細胞外酵素

【研究成果の概要】

海洋中の溶存有機物は、陸上植生、土壌有機物と並んで、地球上の3大有機炭素リザバ-のひとつの数えられている。その変動は、グローバルな炭素フラックス、さらには、大気中最大の温室効果気体である二酸化炭素の年-100年スケールでの変動にも影響を及ぼしうる.本研究の目的は、海洋における溶存有機物の蓄積メカニズムを、微生物生態学と地球化学を融合させた学際的なアプローチを用いて実験的に解明することである。生体ポリマーとして最も重要な成分である、タンパク質を材料とし、海水中における、膜、可溶性タンパク質の分解過程に関する実験的な解析を行った。新たに開発した2重標識トレーサー法を用いて、微生物分解速度定数の違いを求めたけった、膜タンパク質の分解速度定数を溶存タンパク質のそれに比した著しく低いことが始めて実験的に証明された。また、膜の除去により、タンパク質の分解速度定数が高まることも示された。これらの結果は、膜・壁成分による立体障壁が、海水中のタンパク質の保存機構として重要であることを強く示唆している。また、近年、地球化学的な観測により見出された。海水中に膜たん白質が多量に蓄積しているという現象もよく説明できると考えられる。さらに、分解の時間変化の解析から、膜一タンパク複合体を破壊するために、海洋細菌が多様な加水分解酵素を合成することも示された。以上の知見は、海洋における溶存有機物の変動をモデル化するうえで重要な意義を有する。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】6,800千円 (直接経費: 6,800千円)

【研究分野】環境動態解析

【研究領域課題番号】06680489 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

海洋炭素循環 / 微生物 / 溶存有機物 / コロイド / タンパク質 / 分解 / 細菌 / サブミクロン粒子 / 海洋物質循環 / 高分子溶存有機物 / 微生物分解 / 細胞外酵素

【研究成果の概要】

1.還元的メチル化法により高比活性に放射標識したモデルたんぱく質(BSA,牛血清アルブミン、分子量66kD)を用い、海洋細菌による高分子加水分解速度を高感度かつ比較的簡便に測定する方法論を完成させた。
2.放射標識BSAをポリスチレンの人工微粒子(径0.1-1.5um)に吸着させ、それを、細菌に分解させる実験系を新たに構築した。これにより、粒子の数やサイズを厳密に制御して、分解速度を明らかにすることが始めて可能になった。
3.上述の方法論を応用し、単離海洋細菌、海洋細菌混合集団、および、天然海水中の微生物群集による、モデル高分子溶存有機物の分解速度の解析を行った。その結果、分解速度が粒子のサイズに強く依存し、そのパターンが、粒子間の衝突確率を求める物理モデルの予測結果と定性的に一致することが明らかになった。
4.遊離のたんぱく質に比べ、微粒子に吸着したたんぱく質は、その分解速度が著しく低下した(1/10-1/200)。低下の程度は、細菌の種類に依存し、細胞外酵素系の特性が、吸着たんぱく質の分解に大きな影響をおよぼしているものと推察された。
5.以上の結果は、海水中に多量に存在する、サブミクロン粒子およびコロイドが、溶存有機物の分解性の低下に大きな役割を果たしているという本研究の作業仮説を支持した。この知見は、海洋炭素循環の仕組みと、海洋生態系の安定性を考えるうえで重要な意義を持つ。その内容は国際学術誌に原著論文として投稿し、受理された。研究費の主要な支出項目は、実験消耗品費と研究討論の旅費である。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)