【研究領域課題番号】18H03980 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / タンパク質 / ＲＮＡ / 複合体 / 分子機構 / RNA / X線結晶解析 / 修飾酵素 / プロセシング / 結晶構造解析 / 蛋白質 / 構造 / 機能 / X線 / 構造解析 / 機能解析 / RNA－蛋白質複合体 / X線構造解析 / ノンコーディング / 鋳型非依存 / 機能制御

【研究成果の概要】

本研究では、高次生命現象を支配する鋳型非依存的ＲＮＡ合成酵素のうち、let7 miRNAの発現を制御するTUT4/7によるポリU付加の分子機構をLin28と相互作用するTUT4/7の領域の構造解析、生化学的解析より明らかにした。また、U6 snRNAの成熟化に関わるTUT1によるポリU付加の分子機構をTUT1とU6 snRNAの複合体構造解析、生化学的解析より明らかにした。RNAのポリA鎖にA/Gミックス鎖を付加するTENT4/Bの構造解析に成功し、ヌクレオチドの特異性に関する知見を得た。また、各種RNA修飾酵素、プロセス酵素の構造決定に成功し、それらの酵素の反応制御機構を明らかにした。

【研究の社会的意義】

本研究で明らかにしたTUT4/7によるpre-let7のLin28依存的ウリジル化の分子機構はがん抑制作用のあるlet7 miRNAの発現を制御する薬剤開発の基盤になり、また、U6 snRNAの成熟化に関わるTUT1によるウリジル化の分子機構はU6 snRNAの成熟化異常に起因する疾病に対する薬剤の開発の基盤になると期待できる。また、HBCなどのmRNAを安定化させるTENT4A/4Bの特異性の分子機構解明はウイルスの増殖に対する薬剤の開発などの基盤となると期待できる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】43,810千円 (直接経費: 33,700千円、間接経費: 10,110千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】17K07448 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 転写制御 / 分子認識 / GRASファミリー / 結晶構造解析 / IDDファミリー / 転写因子 / タンパク質間相互作用 / パターン形成 / 蛋白質 / 生体分子 / シグナル伝達 / 植物 / 発現制御

【研究成果の概要】

植物の根の形態形成に関与するGRASファミリーと転写因子IDDファミリーの相互作用に着目して、構造生物学的・生化学的手法を用いてより詳細な転写制御の分子機構の解析を行った。GRASファミリーのSCL3とIDDファミリー複合体のX線結晶構造解析を行った結果、既存のGRAS-IDD相互作用とは異なる新規の相互作用であることが明らかとなった。また、生化学的な解析から転写因子IDDファミリーとGRASタンパク質の組み合わせによって多数のタンパク質から構成される複合体が形成され、複雑な転写制御が行われている可能性が示唆された。

【研究の社会的意義】

植物の根の形態形成は成長過程と調和して転写制御をオン・オフにするため、複雑に制御されている。本研究では根の形態形成に重要な2つのファミリーGRAS, IDDファミリーについてその立体構造解析と分子相互作用解析の結果から、GRASファミリーとIDDファミリーの相互作用様式には多様性があることを示し、結合する組み合わせによって様々な転写制御複合体を形成し得ることを明らかにした。本成果は植物の複雑な転写制御機構の理解を深めると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】24227004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / チャネル / トランスポーター / 遺伝学 / 電気生理学 / 膜輸送体 / リポソーム解析 / 計算機シミュレーション / 遺伝学解析 / パッチクランプ / 高分子構造・物性 / X線 / 生体分子 / タンパク質 / 薬理学

【研究成果の概要】

イオンチャネルに関しては，新規に同定したMg2+チャネルMgtE，TRICチャネル，P2Xチャネルに関して高分解能の結晶構造に基づき，基質認識機構，輸送制御機構を解明した.トランスポーターに関しては，Ca2+/H+交換輸送体CAX，Fe2+排出輸送体FPN，糖の排出輸送体SWEET，ペプチド輸送体POT，アミノ酸排出輸送体YddG，多剤排出輸送体MATE，膜蛋白質の膜組み込みに働くYidCの高分解能構造を決定し，基質認識機構，輸送機構を解明した.また，チャネルロドプシン，光駆動型Na+ポンプKR2の高分解能構造を決定し，光による輸送駆動機構を解明した.

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2012-05-31 - 2017-03-31

【配分額】217,880千円 (直接経費: 167,600千円、間接経費: 50,280千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23770106 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / 自然免疫 / Ｘ線結晶構造解析 / 結晶構造解析

【研究成果の概要】

本申請課題において、核酸認識TLR受容体(TLR7,TLR8,TLR9)についての蛋白質調製、結晶化、構造解析を進めた。TLR8に関しては、リガンド非結合状態と低分子リガンドとの複合体の状態での構造解析に成功した。TLR7とTLR9に関しては、結晶化可能な量の蛋白質を得ることに成功し、複数の状態での結晶を得ている。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】生物物理・化学物理

【研究領域課題番号】22244054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質水和 / 水和構造 / 分子動力学シミュレーション / 蛍光分光 / 和周波測定 / 非線形光学 / Ｘ線結晶構造解析 / 主成分分析 / 蛋白質水和構造 / 水和構造解析 / ドメイン運動 / 溶媒応答 / トリプトファン蛍光 / 分子動力学計算 / 水素結合 / 時間分解蛍光測定 / 和周波 / Ｘ線小角度散乱 / タンパク質 / 和周波分光 / X線小角散乱 / 溶媒応答関数 / 低温X線結晶構造解析 / 蛍光発光 / 蛋白質水和 / 悲線形光学現象 / 結晶構造解析 / 遺伝子組み換え / 溶媒応咎関数 / 溶媒和 / フェムト秒レーザー

【研究成果の概要】

生命活動の素過程を担うタンパク質分子は水環境において構造形成し機能する。何故水環境を必要とするのかを理解するには、タンパク質表面での水分子の運動をピコ秒時間分解能と原子分解能で探る必要がある。本研究では、タンパク質からの時間分解蛍光測定装置を開発しながら、特徴的なドメイン運動を行うタンパク質について、その運動の原因となっている水和構造変化を蛍光測定、結晶構造解析などの実験と大規模な分子動力学シミュレーションの両面から解析することを試みた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010-04-01 - 2014-03-31

【配分額】48,100千円 (直接経費: 37,000千円、間接経費: 11,100千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15370065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バクテリオファージ / 分子機械 / 分子認識 / 分子集合 / 感染 / 超遠心分析 / X線結晶構造解析 / 微生物 / 超分子構造 / リゾチーム / テイルリゾチーム / 収縮姓尾部 / 感染機構 / バクテイオファージ / T4ファージ / プロセッシング / 蛋白質工学 / T4類縁ファージ / βヘリックス

【研究成果の概要】

本研究は、バクテリオファージの収縮性尾部を対象として、ナノマシーンとしての尾部の分子集合機構および作動原理を分子・原子レベルで明らかにしようとするものである。3年間の成果のうち、特に重要なものは以下の通りである。
パーデュー大学ロスマン教授のグループとの共同研究により、尾部収縮後の構造が電顕画像からの3次元像再構成によって明らかになった。収縮後の低分解能の電子密度にもこれまでに決定された7つの蛋白質の高分解能構造が無理なくあてはまったことにより、構造変化では個々のサブユニットの構造は大きく変化せず、主に配置変換によってマクロな構造変化が起こっていることが明らかである。さらに、この構造変化の主役を担っているのがgp10で、この蛋白質が長軸に関して回転することにより、それまでgp12(小尾繊維)に結合していたgp11が尾繊維(gp34)に結合することが分かった。
テイルリゾチームgp5はプロセッシングを受けて351残基目のセリンのC端で切断されるがこれをロイシンに置換したgp5は切断が起きないことが分かったので、この変異体を調整して構造決定を行うことが出来た。その結果、これまで明らかでなかった切断部位周辺の15残基の構造が明らかになり、また、隣のサブユニットから出ているペプチドが基質認識部位を占拠することによってリゾチーム活性を抑制している現象は切断の結果ではなく、切断以前に起こっていることが分かった。
T4類縁ファージKVP40のテイルリゾチームgp5の単離・性状解析およびgp27対応蛋白質の発見:テイルリゾチームgp5はリゾチームドメイン・C末端β-helixを含む特異な構造を有し、N末端ドメインでgp27と結合し、gp27を介して基盤と結合している。T4近縁のファージではgp5のドメイン構造は良く保存されているが、遠縁になるに従って類似性が低くなる。KVP40のgp5ではリゾチームが欠損している。このgp5をクローニング、発現、単離して、性状解析を行ったほか、通常のbalst検索では検出されないが、ORF334を候補と考えてクローニング・単離・精製を行ったところ、この蛋白質がgp5と強く結合することが確認された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】13480214 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質結晶学 / 極低温結晶構造解析 / 分子動力学計算 / 蛋白質水和構造 / ドメイン運動 / ガラス転移 / バイオイオンフォマティクス / バイオインフォマティクス / 蛋白質 / 水和構造 / 低温結晶解析 / 蛋白質水和 / X線結晶構造解析

【研究成果の概要】

精緻な分子機械である蛋白質の動作原理や構造構築原理を解明し、その巧みさを学び取ろうと、膨大な数の立体構造解析が行われている。一方で、蛋白質がなぜ水の中で立体構造形成するのか、水は蛋白質ダイナミクスにどのような影響を及ぼすのかといった点については十分明らかにされてきたわけではない。本研究では、蛋白質と水の相互作用をより深く知ることで、蛋白質の立体構造形成、ダイナミクスや機能発現における水の役割をミクロスコピックに解明するための研究の展開を試みた。研究代表者は、これまでに極低温高分解能X線結晶構造解析の方法論を確立すると共に、同解析が蛋白質の水和構造について重要な知見をもたらすことを明らかにしてきた。本研究では、極低温高分解能結晶構造解析、分子動力学計算を実施するとともにプロテインデータバンクに登録された立体構造モデルを利用して、以下の項目について研究を実施し、論文発表を行うと共に、各種国内・国際会議から多数の招待講演を受けた。
(1)蛋白質水和構造の特徴づけ。
(2)水和構造の動的性質と蛋白質ダイナミクスの相関。
(3)極低温解析と分子動力学計算で得られる水和構造の比較。
(4)水和構造の解析、データベース化、水和構造予測計算プログラムの構築。
(5)蛋白質のガラス性転移と水和構造の相関解析
(6)低温結晶構造解析用装置類の開発と構造解析への応用。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】8,800千円 (直接経費: 8,800千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】11558086 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 放射線損傷 / 低温結晶解析 / 大型放射光 / 低温冷却 / 低温蛋白質結晶学 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / X線解析 / X線回折 / 放射光X線 / 中性子回折

【研究成果の概要】

大強度X線の利用が可能な大型放射光ビームラインでは、100Kにおいてさえ放射線損傷が生じることが明らかとなってきた。この現象は、10^<12>〜10^<13>photon/秒にもおよぶ大強度X線によってガラス状に凍結された水が部分的に溶解し、発生したラジカルが拡散している可能性を強く示唆するものであった。この現象に立ち向かうには更に低い温度での回折実験が有効であることが低温電子顕微鏡法による生体高分子の観察において明らかにされている。本研究では、従来の低温窒素ガス吹き付け型結晶冷却装置と変わりない操作性を有し、試料を35K程度に冷却可能な吹き付け型結晶冷却装置の開発を行った。同装置の実現は、蛋白質結晶の放射線損傷低減にとどまることなく、室温下ピコ〜ナノ秒程度の時間領域で発生する蛋白質等の反応中間状態を凍結した構造解析や分光測定を用意に可能とし、35K〜80Kの温度範囲に相転移を有した物質の構造解析を含めた物性測定に威力を発揮するものと期待される。今回の装置開発では、より低い到達温度が実現可能なヘリウムガスを冷却媒体として用い、目標温度範囲35K〜300K、温度精度0.5Kを達成した。本装置を大型放射高施設スプリング8のビームライン41XUに設置し、蛋白質(鞭毛構築蛋白質、シタロン脱水酵素変異体)や巨大生体分子複合体(光合成器官II、F1-ATP合成酵素)の極低温X線回折強度データ収集を実施した。
また、従来から開発を行ってきた液体窒素温度周辺での低温結晶解析技術を駆使して、多数の蛋白質の結晶構造(グルタミン酸脱水素酵素、キラートキシン、筋小胞体カルシウムポンプ、シタロン脱水酵素等)や蛋白質の水和構造を明らかにし、.蛋白質内部振動の温度依存性についても精度の高い測定を行った。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】9,800千円 (直接経費: 9,800千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)

【研究分野】結晶学

【研究領域課題番号】02558011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微小結晶 / 蛋白質 / X線結晶構造解析 / イメージングプレート / シンクロトロン放射光 / 異常分散法 / 免疫グロブリン / 抗体 / X線結晶構造解析法 / 蛋白質結晶学 / 回折強度測定法 / イメ-ジングプレ-ト / 多波長異常分散法

【研究成果の概要】

微小蛋白質結晶のX線構造解析法の開発を目的とし、輝尽性蛍光体イメージングプレートを採用した高感度で高精度のX線カメラ露光リアルタイム検出装置を試作し、X線異常分散効果を利用して構造解析の処理を行うための計算機プログラムシステムを開発した。これらを用い、シンクロトロン放射光による異常分散効果を最適化した回折データを微小蛋白質結晶について測定し、抗体など3種の蛋白質の結晶構造を解析した。
ダンシルリジンに結合するマウス抗体のFvフラグメントについて、多波長異常分散法用の回折データ処理と異常分散項の算出処理のプログラムを用いて解析を進めた。その結果、異常分散パターソン合成による相補性決定部位のメチオニンに結合した白金のサイトを得ることができた。その後、分子置換法とモデル精密化法を併用してこのFvフラグメントの結晶構造を1.6A分解能という抗体では最も高い精度で解析を完了することができた。白色X線による異常分散効果の測定系と処理系も新たに開発し、ラウエ回折法に基づく今後の時分割実験による動的構造研究でも適用可能となった。
マウス抗ニトロフェノール(NP)抗体3B44のFavフラグメンの微小結晶について、開発した検出装置を用いることにより3A分解能の回折データを得ることができた。このものの臭素化NPとの複合体の多波長データでは臭素化NPの結合が十分でなかったため分子置換法を適用し、3A分解能で構造解析に成功した。また、抗体NIG9のFabでも結晶が微小で従来法では回折データが得られなかったが、開発した測定処理系によって2.5A分解能の良好なデータを得た。さらに、リボヌクレアーゼU_2も1.8A分解能での解析を完了した。このものの異常分散差フーリエ合成ではイオウ原子のみを明瞭に電子密度として見いだすことができた。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1992

【配分額】17,500千円 (直接経費: 17,500千円)