【研究領域課題番号】20H03375 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

NMR / GPCR / Gタンパク質 / アレスチン / システム生物学 / G蛋白質 / 膜タンパク質 / アドレナリン受容体 / オピオイド受容体

【研究成果の概要】

(1) 【b2AR および mOR の各モチーフの構造を反映する NMR シグナルの観測、帰属】
b2ARに関しては、部分重水素化およびチロシン残基の主鎖15N標識を施したb2ARのNMRスペクトルを測定して、残基数に対応する数のシグナルを観測した。各チロシン残基の変異体のスペクトルを測定して、野生型と比較することにより、モチーフ近傍に位置する3残基のシグナルを帰属することに成功した。mORに関しては、膜貫通領域上の6つの残基にメチオニン残基を変異導入したmORのNMRスペクトルを測定して、シグナルを帰属した。

(2) 【各リガンド結合状態の b2AR および mOR のシグナルの観測】
b2ARに関しては、(1)で帰属したチロシン残基のNMRシグナルを、逆作動薬結合状態と作動薬結合状態で観測した。その結果、作動薬結合状態では、いずれのシグナルも逆作動薬結合状態と比較して広幅になっており、モチーフが特定の構造に安定化されておらず、構造多型が存在することが示唆された。
mORに関しては、完全作動薬結合状態と部分作動薬結合状態、およびシグナル伝達活性が向上する変異を導入した状態で、各メチオニン残基のNMRシグナルを測定した。その結果、モチーフの近傍に位置する残基のシグナルが三つ観測され、各シグナルの相対強度がシグナル伝達活性に対応して変化することが観測された。これらの結果から、mORが不活性型、部分活性型、活性型の間の構造平衡状態にあり、各状態の存在割合がシグナル伝達活性を規定していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】16K18866 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

HBV / 溶液NMR / B型肝炎ウイルス / NMR / 構造生物学 / B型肝炎ウィルス / X線結晶構造解析 / ウイルス / 膜タンパク質

【研究成果の概要】

B型肝炎ウイルス（HBV）の感染により発症する慢性B型肝炎は、肝癌や肝硬変のリスク因子である。現在の治療薬は核酸アナログとインターフェロンのみであり、ウイルスを排除できないことが問題である。そこで本研究では、HBV感染の構造メカニズムを明らかにし、治療薬創製の構造基盤を得ることを目指した。
感染に重要なHBVの外殻タンパク質であるpreS、preS1、preS2の大量調製法を確立し、NMRシグナルの帰属を行うことで、HBV受容体であるNTCPとの相互作用解析の準備が整った。NTCPは大腸菌での発現に成功した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】15K18843 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / NMR / 膜タンパク質 / シグナル伝達 / GPCR

【研究成果の概要】

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)のリガンドには、Gタンパク質とアレスチンを介したシグナル伝達経路の一方を選択的に活性化するものが知られており、この現象を「シグナルバイアス」と呼ぶ。本研究では、薬理学的に重要なGPCRについて、メチオニンメチル基に由来するNMRシグナルを、通常のリガンドが結合した状態とバイアスリガンドが結合した状態で解析した。その結果、GPCRは不活性型構造に加えて複数の活性型構造をとること、複数の活性型構造の割合がGタンパク質およびアレスチンを介したシグナル伝達の強度を決定していることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】25460033 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

GPCR / NMR / 膜タンパク質 / 構造生物学 / 膜蛋白質 / 蛋白質 / 薬学 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

NMRシグナルの感度を従来法の 5 倍以上とする、昆虫細胞発現系で重水素化したタンパク質を調製する手法を開発した。加えて、重水素化を施した上で、rHDLの脂質二重膜中に再構成したb2ARを調製して、各種リガンド結合状態のNMRスペクトルを取得することにも成功した。その結果、rHDL中では、活性型の量比がミセル中より多く、交換速度がミセルにおける値の数分の一であることが示された。
さらに、アレスチンシグナルを選択的に活性化する状態のGPCRのNMRシグナルを観測した。その結果、GPCRが複数の活性型の構造平衡状態にあり、各活性型の割合がシグナル選択性を決定していることが明らかなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】23790042 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / NMR / 膜蛋白質 / 転移交差飽和法 / 過渡的複合体 / ニ成分制御系 / マルチドメイン蛋白質 / 過渡的相互作用 / 膜タンパク質 / タンパク質―タンパク質相互作用 / 交差飽和法 / Protein Trans-Splicing / Segmental labeling

【研究成果の概要】

本研究では、申請者らの開発したNMR手法である交差飽和法を用いて、原核生物の走化性を制御する細胞内シグナル伝達タンパク質であるCheAとCheYの複合体が、反応部位同士が互いに近接した状態と、離れた状態の平衡状態にあることを明らかにした。これにより、CheAが、シグナル伝達に必要な二つの反応を、一つの反応部位で、両方とも効率よく進めているメカニズムが解明された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】20790029 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / 生化学 / 膜タンパク質 / 核磁気共鳴法 / 光合成名反応 / タンパク質-タンパク質相互作用 / 電子移動反応 / 転移交差飽和法 / 光合成明反応 / Membrane protein / NMR / photosynthesis / protein-protein interaction / electron transfer / transferred cross saturation

【研究成果の概要】

プラストシアニン(Pc)は、膜蛋白質複合体である光化学系I(PSI)に素早く電子を輸送することにより、光合成明反応を効率良く進めている。本研究では、酸化型アナログであるカドミウム置換体(Cd-Pc)の調製法を確立して、当研究室で確立した転移交差飽和法(TCS)を用いて、Cd-PcのPSI結合部位を同定した。その結果、Pc上の銅原子の酸化に伴って、Loop1のコンフォメーションが変化することにより、Loop1を介したPSIとの相互作用が減弱し、電子移動後のPSIからの素早い解離が実現され、効率的電子輸送反応が起こることが明らかとなった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】19890049 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

NMR / 膜蛋白質 / 構造生物学 / 転移交差飽和法 / 光合成明反応 / 光化学系I / フェレドキシン / 循環的電子伝達

【研究成果の概要】

安定同位体標識を施したフェレドキシン(Fd)を、大腸菌BL21(DE3)-CodonPlus-RPを用いて大量発現させ、Sepharose 6B、 Resource PHE、 Hiload Superdex 75カラムを用いて、SDS-PAGEにて単一バンドとなるまで精製した。Fdの[2Fe-2S]クラスターは不対電子を持つため、その近傍のNMRシグナルは観測されない。そこで、その影響を見積もるため、Fdの主鎖に由来するNMRシグナルの連鎖帰属を行った。その結果、[2Fe-2S]クラスターの5Å以内に存在するY37-A48およびT76-A79のアミノ酸に対応するシグナルは観測されなかった。次に、Fd上の光化学系Iとの特異的相互作用残基を同定するために、Fdと可溶化した光化学系Iを混合し、TCS実験を行った。さらに、FQRとの相互作用を検出するために、光化学系IおよびFQRのFd結合界面が外側を向いた、right side-outベシクルを用いたTCS実験も行った。両TCS実験の結果を比較すると、K52近傍、D66近傍、V82近傍およびE30-I33は両方のTCS実験においてシグナル強度減少が観測されているのに対し、K4およびD84はベシクルとのTCS実験のみでシグナル強度減少が観測された。このことから、K52近傍、V82近傍、D66近傍およびE30-I33は、PSIとの結合界面上に存在し、K4およびD84はFQRとの結合界面に存在すると結論した。近年、低分子量チラコイド膜タンパク質PGR5がFQRの活性に必須であることが示された。しかし、PGR5がFdと直接相互作用しているか否かは明らかではない。PGR5変異株から調製したチラコイド膜ベシクルを用いたTCS実験における、K4およびD84の強度減少を調べることにより、この点を明らかにしたいと考えている。

【研究種目】若手研究(スタートアップ)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,075千円 (直接経費: 2,670千円、間接経費: 405千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】19590037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜蛋白質 / 分子認識 / NMR / 構造生物学 / 相互作用解析

【研究成果の概要】

脂質二重膜中の膜蛋白質はビーズに固定化することにより、安定性が劇的に向上するが、不溶性成分の共存によりNMRシグナルの広幅化・感度の低下が問題となっていた。そこで、マジック角回転(MAS)による高感度化・高分解能化を目指した。
本研究では、高速MASに耐えることができ、広い固・液界面が確保可能な固定化担体を幅広く比較検討した結果、CM-シリカビーズを見出した。
次に、ユビキチン(Ub)と酵母Ub水酸化酵素(YUH)の相互作用系において、YUHをCMシリカビーズに固定化し、不均一系超分子を模倣した系を作成した。このYUH固定化Zn-NTAシリカビーズを均一2H15N標識したUbの溶液に懸濁し、MAS 条件下で転移交差飽和法の測定を試みたところ、従来法では解析が困難であった固体と液体が共存した超分子系において、Ub 上のYUH 結合界面残基の同定に成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)