【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】15K18668 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

液滴 / 微生物 / 酵素 / マイクロ流体デバイス

【研究成果の概要】

環境中の99%以上の微生物は，現在の技術では培養が困難な微生物（難培養性微生物）とされている．難培養性微生物が産生する酵素は，新たな酵素資源として大きな可能性を秘めている．そこで研究代表者は，環境中に豊富に存在する酵素資源への効率的にアクセスする方法として「液滴を利用した微生物培養を介さない酵素遺伝子取得法」を考案した．本研究を通じて，「液滴を利用した微生物培養を介さない酵素遺伝子取得法」を確立し，その実用性・有用性を実証することに成功した．今後，本法の実践・応用により，産業上有用な酵素をコードする遺伝子が多数取得され，それが新たな酵素産業の創出に結実すると考えられる．

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】ケミカルバイオロジー

【研究領域課題番号】22603013 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微生物 / 酵素 / NRPS / ポリアミノ酸 / 生体機能利用 / 生物活性物質 / バイオ生産プロセス / 二次代謝物 / 物質生産 / 微生物機能 / 二次代謝産物 / 生体触媒工学 / 生物機能工学 / 生体高分子

【研究成果の概要】

ペプチドは近年注目を集めている機能性食品や医薬品原料として期待されている。本研究では、ポリアミノ酸合成酵素の機能解析を目指して、種々の新規なポリアミノ酸生産菌の取得とライブラリー化、ならびに合成機構に関する検討を行った。色素排除を指標としたスクリーニングとMALDI-TOF MS解析により、 新規な塩基性ポリアミノ酸生産菌を含む種々の生産菌を取得した。また、 NPRS様配列の取得と発現解析を通してNRPS様遺伝子の解析を行った。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】16380056 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Thermus属細菌 / リジン生合成 / 基質特異性 / X線結晶構造解析 / 分子進化工学 / 転写調節 / 生合成 / アミノ酸 / 酵素 / 進化 / 微生物 / 気質特異性

【研究成果の概要】

1)Thermus thermophilusにおいて、ホモアコニターゼの酵素学的諸性質を解析し、同酵素が第3番目の反応を触媒出来るものの、第2番目については触媒出来ないことを明らかにした。2)αアミノアジピン酸アミノ基転移酵素(AAA-AT)について、ピリドキサールリン酸(PLP)複合体構造、およびPLP+ロイシン複合体構造などをX線結晶構造解析により決定した。AAA-ATは、リジン生合成の基質である2-オキソカプロン酸だけでなく、ロイシン生合成、フェニルアラニン生合成の対応化合物に対しても高い活性を有している。その基質認識機構を、タンパク質の立体構造決定することにより解析した。稼働性が高いN末端のα1ヘリックスが基質側鎖の性質に応じて移動すると同時に、同ヘリックスに存在するArg残基が活性発現に重要な役割を持っていることを明らかにした。3)DNAシャッフリングにより、ロイシン生合成の対応基質2-イソプロピルリンゴ酸に対して高い活性を示す改変型ホモイソクエン酸脱水素酵素を作製した。得られた酵素、および導入された個々の置換の効果を解析し、それら何れの置換も基質特異性の変換に効果があることが明らかにした。4)AAAのαアミノ基の修飾を行う酵素LysXについて、T.thermophilus HB27株のもの、およびSulfolobus tokodaiiのLysXパラログについて、結晶化に成功した。5)主要リジン生合成酵素遺伝子クラスターの転写はリジンによって制御されていることを明らかにした。その様式は大腸菌のtrpオペロンに類似したattenuation機構であった。さらに、同クラスターの転写はアルギニン生合成転写調節因子ArgRおよびプロリン代謝転写調節因子PutRによっても制御されていることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】15,700千円 (直接経費: 15,700千円)

【研究分野】生物有機科学

【研究領域課題番号】06353014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体触媒 / 酵素 / 微生物 / 光学活性化合物 / 抗体触媒 / 蛋白質工学 / 細胞融合 / 植物培養細胞

【研究成果の概要】

本総合研究は重点領域研究申請を目的として申請したものであり、予算もそのために使用した。
先ず、5月下旬に慶應義塾大学において日本化学生体機能関連化学部会主催のシンポジウムが開催された際、本申請の代表者及び分担者のうちのシンポジウム参加者が集まり、その後の活動の大枠を決めた。
次に、代表者が中心となって酸素反応、遺伝子操作、蛋白質工学等のバイオテクノロジー、有機反応論、あるいは有機合成化学の相関関係、今後のあるべき姿、その融合によって生まれる可能性のある新しい学門領域等について大いに討論した。日本化学会秋季年会の際には分担者のほぼ全員が集まり、重点領域研究の際の具体的な方針について討論し、決定した。研究班の構成、その研究内容、生物系と有機化学系の連携による新しい研究領域の開拓などが主な確認事項であった。11月には小田原で「生体触媒を利用する有機合成研究会」を開催し、総合研究に参加していない研究者とも討論した。12月に総合研究に参加している全研究者による会議を行い、重点領域研究申請の際の班長に関しては最終案を了承した。また、このときに「生体触媒」のいろいろの分野で研究をリ-ドしている先生方による公開講演会を開催し、この分野の現在の状況を多面的に浮き彫りにすると共に、今後の展望、どの様な展開が望まれるかを明らかにした。
12月に重点領域申請の際に総括班の実行グループを構成する予定のメンバーで申請書の原案に関して討論し、方針を決定した。

【研究種目】総合研究(B)

【研究期間】1994

【配分額】1,800千円 (直接経費: 1,800千円)

【研究分野】有機工業化学

【研究領域課題番号】62550617 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

酵素反応 / ガラクトースオキシダーゼ / グルコースオキシダーゼ / 微生物 / 高選択的分離 / 脱水素 / 選択的資化 / 糖質 / 酵素 / 基質特異性 / 選択的脱水素 / 選択的分解資化 / 選択的酸化 / ウロン酸 / 非天然糖 / オリゴ糖 / L糖

【研究成果の概要】

微生物の酵素による高選択的脱水素(酸化)と天然、非天然型糖質のもつ分子構造的特徴と酸化反応における酵素のもつ分子識別能及び選択性との間の相関に対し、基礎的知見を集積するとともに、化学の側から見た酵素反応について一段階反応から多段階反応まで含めて考察を行った。
はじめにグルコースオキシダーゼ及びガラクトースオキシダーゼの基質特異性について検討を行い、生成物の分析を行った。その結果ガラクトース、マンノース及びキシロースはグルコースオキシダーゼにより相当するラクトンに高収率で酸化された。メチルD-ガラクトシドのC-6ヒドロキシメチルはガラクトースオキシダーゼによりアルデヒド中間体を経て相当するウロン酸に酸化された。分子中にガラクトピラノシル残基を有するオリゴ糖もガラクトースオキシダーゼにより酸化された。これとは対照的に、ガラクチトールやヤシリトールのようなある種の糖アルコールはガラクトースオキシダーゼにより酸化されてL-ガラクトースやL-キシロースのようなL-糖が選択的に得られた。この場合、生成したL-ガラクトース及びL-キシロースはピラノース環を形成することにより安定化し、これ以上の酸化が進行しないものと考えられる。
もし糖質が好気的条件下で資化されるとすれば、全反応は酸化反応(多段階的脱水素)とみなせるであろう。特定の菌体を用いて高選択的資化を、従来の化学的手法では困難な炭水化物の選択的分離に適用した。D-アロース資化菌、Rhodotorla rubra KM603、Trichosporon cutaneum KM609及びAcremonium sp.KM608を活性汚泥より集積培養法により得、糖質のC-2エピマー、α、β-アノマー及びDL-混合物の分離を行った。さらに他の特定の微生物について選択的資化性の検討を行った。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1987 - 1988

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】有機工業化学

【研究領域課題番号】60550597 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ポリマー / 高分子電解質 / 機能性 / 生分解性 / 分子設計 / 微生物 / 酵素 / 生分解機構

【研究成果の概要】

機能性を有する水溶性ポリマーに生分解性を付与するための分子設計としてポリマーに種々の酵素反応に活性を示すことが予想される官能基を種々の位置に導入する方法について検討を行い、得られたものについて、生分解性及び分解菌の単離同定と分解機構の推定を行った。今年度は特にラジカル共重合によりポリアクリル酸鎖などのポリカルボン酸鎖に容易に導入が可能で、かつ前年度の研究で生分解性が認められたビニルオキシ酢酸について詳細な検討を行った。ポリビニルオキシ酢酸(PVOA)は、その分解菌を土壌より集積培養法により単離を行った結果Bacillus cereusなど8菌株が得られた。これらはいずれも細菌であり、分解様式は菌株によって異なったが、いずれもPVCAを分解質化することが確認され、またアクリル酸-ビニルオキシ酢酸コポリマーも同菌によって分解質化されることが認められた。同様にアクリル酸-ビニルアルコール系コポリマーも水酸基の導入により生分解性を示す様になることが確認された。分子内にエーテル結合を導入したポリカルボン酸を系統的に合成したが、これらのうちエポキシコハク酸の重合より得たポリコハク酸が生分解性及び機能性にすぐれた外は、相当するエーテル結合を含まないポリカルボン酸に比べて生分解性の向上は見られたものの、機能性は低下した。分子内にエステル結合を導入したポリマーは生分解性の面では特に顕著な生分解性の向上が認められたが、カルボキシラート密度がエーテル結合の場合に比べさらに低下することに起因し、機能性の低下が顕著に見られ、今後、この面での分子設計的な検討が必要とされるものと考えられる。生分解性の点から見れば、ポリマーの主鎖中にエステル結合を導入することが最も効果的であることが見い出され、このようなポリマーを得る新しい重合法の検討も必要とされるものと考えられる。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1985 - 1986

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)