【研究領域課題番号】22H03045 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生・分化 / 遺伝子 / 循環器・高血圧 / 発現制御 / シグナル伝達

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2022-04-01 - 2025-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究領域課題番号】21H02500 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

植物 / 発生・分化 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

本研究では、植物小ベプチドであるCLE1p-CLE7p、pCLE43p、CLE45pなどを対象に乾燥、光、感染、温度といった環境刺激の応答性とシグナル機能を解析し、どのようにそれらの環境刺激を仲介するのかを明らかにすることを目的とした。本年度は特に以下の項目について成果を得た。
１．CLE3の発現制御の研究を進めた。定量的リアルタイムPCR解析により、CLE3の発現はNPR1依存性サルチル酸（SA）シグナル伝達およびFLS2シグナル伝達経路によって調節されていることが明らかになった。根においてSAに誘導されるCLE3pの発現がシュートにおけるWRKY33遺伝子の活性化に必要であることを明らかにし、システミックなシグナルの存在を示唆した。beta-エストラジオール誘導性プロモーターの制御下でCLE3を過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナ系統を作成し、マイクロアレイ解析をした。その結果、根に限定されたCLE3の過剰発現がシュートでの遺伝子発現に影響を与えることが明らとなった。これらの結果をもとに、Plant Molecular Biology誌に論文を発表した。
２．CLE5は乾燥刺激により，唯一その発現が上昇する遺伝子であった。そこで、本年度はそのシグナルの実態に迫るために、松林博士と共同研究でCLE5を過剰発現された植物体から、その産物を分離同定した。その結果、活性型CLE5pは2つのヒドロキシプロリンを持つペプチドであることを明らかとした。
３．CLE43の低温誘導性について、pCLE43-GUSを導入した植物を用いて調査をした。その結果、葉では恒常的に発現しているが、雌蕊では低温時にのみ発現することが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究領域課題番号】19H03622 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

多因子遺伝 / 総動脈幹症 / TBX1 / Tbx1 / 発生・分化 / 遺伝子 / 発現制御 / シグナル伝達 / 循環器・高血圧 / Tbx20 / 心臓神経堤細胞 / 二次心臓領域

【研究成果の概要】

22q11.2欠失症候群に合併する先天性心疾患の責任遺伝子であるTBX1の発現を遺伝子改変技術で低下させたマウスモデルにおいて、妊娠母マウスに葉酸を投与することにより、胎仔の先天性心疾患表現型を軽症化することに成功し、葉酸によりNOTCHシグナルが活性化され、心臓前駆細胞である神経堤細胞の発生分化異常が救済される機序が示唆された。また、遺伝子改変マウスの交配実験によりTBX1と同じ遺伝子群のTBX20が心臓発生において遺伝的相補性を持って機能することが明らかになり、下流転写因子PITX2の発現を制御することにより心臓ルーピングおよび心室中隔形成に関与すると考えられた。

【研究の社会的意義】

本研究課題におけるTBX1とTBX20の遺伝的相補性が示された成果は、多因子遺伝と考えられる複雑先天性心疾患の発症分子機序解明のための一つの基礎的知見として重要である。また、ヒト染色体・遺伝子異常そのものを治療・修復する医療は困難だが、葉酸によるTbx1発現低下マウスの心疾患表現型の軽症化および心臓神経堤細胞の機能回復とその分子経路を示唆した本研究成果の学術的意義は高く、将来的にヒト22q11.2欠失症候群の心疾患を軽症化する治療・予防法につながる可能性を示すことから、数多くの心疾患への応用を含めて社会的意義は大きい。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】昆虫科学

【研究領域課題番号】17H03940 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

性決定 / 性分化 / エクダイソン / doublesex / dmrt遺伝子 / Masculinizer / long-non-coding RNA / DMRT遺伝子 / TALEN / CRISPR/Cas9 / 胚致死 / 昆虫 / シグナル伝達 / 遺伝子 / 発現制御 / 発生・分化 / 性ホルモン / カイコ / ホルモン

【研究成果の概要】

本研究課題では、昆虫の代表的なステロイドホルモンとして知られるエクダイソンが、昆虫の性分化の制御に関与するか否か、また、関与するのであれば、その作用機序はいかなるものであるか、という点を明らかにすることを目的としている。本研究成果により、昆虫性分化のマスター制御遺伝子であるdsxの精巣における発現がエクダイソン濃度依存的に上昇することが判明した。免疫組織化学による発現部位解析、ゲノム編集による表現型解析、エンハンサー解析の結果から、内部生殖器の雄化はdsxだけでは説明できず、その同族遺伝子であるdmrt93Bが必要であること、エクダイソンの応答にもこの遺伝子が関与することが示唆された。

【研究の社会的意義】

本研究では、内部生殖器の性分化がdsxだけでは説明できず、その同族遺伝子dmrt93Bが内部生殖器の雄化にとってより重要な働きをもつことを明らかにできた。これは、昆虫性分化のマスター制御因子であるとのこれまでの見解に一石を投じる発見と言える。dsxの精巣における発現がエクダイソン濃度依存的に上昇することを明らかにすると共に、この過程にdmrt93Bが関与するという新たな知見をもたらしたという点でも学術的価値が高い。また本研究では長年謎であった、雄化因子MASCがdsxの雄型アイソフォームの産生を制御する分子機構を解明し、性決定研究にブレークスルーをもたらしたという点で学術的意義が高いと言える。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,900千円 (直接経費: 13,000千円、間接経費: 3,900千円)

【研究分野】口腔科学およびその関連分野

【研究領域課題番号】17K19746 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 再生医学 / 発生・分化 / 細胞周期 / エクソソーム

【研究成果の概要】

本研究は、エクソソームを介した細胞間情報伝達機構と細胞周期制御機構に着目して、破骨細胞ならびに骨芽細胞分化を統合的に制御する分子、すなわち、「新規骨代謝カップリング因子」の探索を行い、骨代謝メカニズムの理解を深めるとともに、その結果を利用した新規骨再生治療法開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として企画された。
前年度までの研究と同様に、マウス由来骨芽細胞と同破骨細胞を用いて、エクソソームを介した破骨細胞・骨芽細胞間情報伝達機構の存在確認と細胞周期制御ならびに細胞分化への関与を検討した。前年度の実験条件をさらに細かく変更し、骨芽細胞については、通常培養と各分化段階（初期分化段階、中期分化段階、最終分化段階）の細胞からエクソソームを抽出した。また、破骨細胞については、破骨細胞前駆細胞通常培養、分化誘導直後、最終分化後、の各培養条件で培養した細胞からエクソソームを抽出した。骨芽細胞由来のエクソソームを各分化段階の破骨細胞へ、破骨細胞由来のエクソソームを各分化段階の骨芽細胞へ、それぞれ導入し、その後エクソソーム導入が細胞に与える影響を評価した。具体的な評価手法としては、導入細胞における各種分化マーカーの発現と細胞周期制御分子の発現を定量RT-PCRで解析することに加え、形態的な変化も観察した。このように、前年度までの実験結果を参考に、さらにエクソソームのサンプリング時期とその導入時期、細胞培養期間の組み合わせを変えることによってエクソソームを介した骨芽細胞・破骨細胞間情報伝達機構の存在を探った。しかしながら、明確にエクソソームを介した骨芽細胞・破骨細胞間情報伝達機構の存在を示す結果は得られなかった。そのため、網羅的な解析手法を用いて骨芽細胞由来のエクソソームに含まれるマイクロRNAで候補分子となるものを検索開始した。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2017-06-30 - 2023-03-31

【配分額】6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】16H06377 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生・分化 / 転写因子 / 維管束 / シグナル伝達 / 植物生理 / 植物 / 維管束分化

【研究成果の概要】

多細胞生物は多様な細胞が密に作用し合って個体としての機能を果たす。私たちは、この多様な細胞が作られる仕組みを理解するために、植物の維管束幹細胞をモデルにして、その形成から分化までの過程を解析した。その結果、植物幹細胞のもつ多分化能の維持とその分化決定を制御する複数の鍵転写因子を発見するとともに、GSK3のキナーゼ活性などのように細胞内酵素活性が分化のスイッチングを制御していることを明らかにした。

【研究の社会的意義】

本研究では、私たちが開発した植物組織・細胞培養系を駆使して、維管束幹細胞の発生運命決定の仕組みについて研究し、維管束幹細胞の確立、維管束幹細胞からの維管束細胞分化制御、木部・篩部分化のスイッチング制御における新たな仕組みが明らかとなった。この成果は、多細胞生物の多様な細胞が分化する仕組みの一端を明らかにしたもので、多細胞生物の成り立ちを理解するための重要な一歩となったことから、学術的・社会的成果は大きいと考える。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2016-05-31 - 2021-03-31

【配分額】184,340千円 (直接経費: 141,800千円、間接経費: 42,540千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16H05445 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 骨代謝 / 発生・分化 / RANKL / Wnt / Frizzled / 発生分化

【研究成果の概要】

RANKL逆シグナル経路は、in vitroで骨芽細胞分化の促進作用が明らかになっており、Wntシグナル古典経路は、in vivoでも骨芽細胞分化の促進作用が明らかになっていた。しかし、Wnt非古典経路の影響や、RANKL　逆シグナル経路との相互作用など、不明な点は多く残されている。本研究では、RANKL逆シグナル経路がin vivoでも、骨芽細胞分化を促進し、骨吸収抑制と骨形成維持を両立させる、新規創薬標的になり得ることを示した。また、Wnt下流４経路の活性化パターンを、網羅的に測定する手法が完成した。さらに、Wnt/Ca経路は、細胞表面上Caチャネルとの共役が必須である可能性が示唆された。

【研究の社会的意義】

RANKL逆シグナル経路が、生体レベルでは骨吸収と骨形成の共役機構の一部として機能している、と言う仮説をサポートする結果が得られると共に、骨粗鬆症などの骨破壊疾患に対する新たな創薬標的になり得ることを示し、臨床的・医学的に意義の大きい成果が得られた。また、非常に複雑なWntシグナル経路の活性化パターンを定量的に評価する手法を確立し、非古典経路の一部であるCa経路の活性化機構に関して、新規の知見が得られ、生物学的にも意義の大きい成果が得られたと考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】16H05359 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生・分化 / 遺伝子 / 循環器 / 発現制御 / シグナル伝達 / 循環器・高血圧

【研究成果の概要】

22q11.2欠失症候群モデル（Tbx1発現低下）マウスの総動脈幹症の病型が、妊娠母体マウスへの葉酸投与により軽症化した。その機序として、流出路中隔を形成する間葉系細胞の発生障害が、葉酸により救済されることを解明した。そして、心臓の発生および神経堤細胞の遊走・分化を制御する複数の因子の発現が、葉酸により変化することを明らかにした。また、Tbx4が肺間葉系細胞の未分化維持に機能することを明らかにし、その分子機序として、Tbx4が分泌性増殖因子Fgf10の発現を直接制御することを解明した。さらにCRISPR/Cas9システムを用いてTbx20欠損マウスを作製し、Tbx1との遺伝的相補性を検討した。

【研究の社会的意義】

本研究の結果として、多因子遺伝の先天性心血管疾患の成因解明に対して新たなアプローチが確立する。今後、複雑な先天性心血管疾患に対する新たな治療戦略として、幹細胞による再生医療の応用が期待されており、このような成果による個々の先天性心血管疾患の成因解明の蓄積は、オーダーメード医療のための基礎的知見として重要である。ヒト染色体・遺伝子異常症の染色体や遺伝子そのものを治療・修復する医療は困難だが、本研究によるTbx1発現低下マウスの心血管疾患の表現型の軽症化する環境・epigenetic因子またはその分子経路の特定は、将来22q11.2欠失症候群の心疾患を軽症化する治療法の実現につながる可能性がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】16H05538 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

micro RNA / 細胞周期 / 骨代謝 / 発生・分化 / 再生医学 / microRNA / シグナル伝達 / 骨代謝学 / 細胞分化

【研究成果の概要】

研究課題

【研究の社会的意義】

本研究によって、Cdk6によって制御されるとともに骨代謝において重要な機能を果たす複数のmicroRNAと、それらのmicroRNAのターゲット分子が同定された。これらの研究成果は過去に報告のない新たな知見であり、今回同定されたmicroRNAとターゲット分子に関して詳細な解析を行うことによって、現時点では治療法が見つかっていない骨系統疾患や難治性骨折などの新規治療法開発に繋がる可能性がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】植物分子・生理科学

【研究領域課題番号】15K14549 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 発現制御 / 発生・分化

【研究成果の概要】

本研究では、これまで申請者が独自に作製してきたトランスジェニック植物体を活用し、花が咲く時に植物体で起きるエピジェネティックおよびシグナル伝達系の変化を解析することにより、「Deathホルモン」―花からメリステムに至る新規シグナルの分子的実体やそのシグナル経路を同定することを目指して研究を行ってきた。最初に、遺伝学的、生化学的解析によりKNUタンパク質によるWUS遺伝子の抑制における二段階の転写抑制機構を見いだした。さらに、花が咲く時に起きるメリステム間のシグナル伝達を明らかにするために、カルシウム、ATP、植物ホルモンをリアルタイムで定量性をもって検出するためのバイオセンサーを作出した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】発生生物学

【研究領域課題番号】26291047 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経遺伝学 / ショウジョウバエ / 軸索投射 / 受容体型膜タンパク質 / 軸索間相互作用 / 神経生物学 / 神経回路形成 / カドヘリン / リガンド・受容体 / 視神経系 / 発生・分化 / 神経科学 / シグナル伝達 / 脳・神経 / 遺伝子 / 発生生物学 / 軸索誘導 / 視覚神経系

【研究成果の概要】

Fmiの機能解析をサナギ初期において初めて行ったところ、Fmiはフィロポーディアの形成と伸長を促進する機能を持っていることがわかり、Gogoはこれを抑制する機能を持っていることが分かった。このGogoの機能が、サナギ初期でR8軸索どうしが距離を一定に保つことにつながっている。サナギの後半でGogoの発現が弱くなると、Fmiのフィロポーディア伸長のスイッチが入り、R8がM3に到達することになる。これは、軸索どうしの一定間隔の維持に、フィロポーディアの活動を抑制するというGogoの機能が深く関係していることを示唆している。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】16,770千円 (直接経費: 12,900千円、間接経費: 3,870千円)

【研究分野】動物生理・行動

【研究領域課題番号】26440184 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞・組織 / シグナル伝達 / 生体分子 / 生理学 / 発生・分化 / 非神経性アセチルコリン / オルガノイド / 腸幹細胞 / コリン作動系 / 腸上皮 / 腸オルガノイド / ニコチン性アセチルコリン受容体 / 腸上皮幹細胞

【研究成果の概要】

研究代表者は腸オルガノイド培養系を用いて、腸上皮細胞内ACh産生系が存在すること、及び腸上皮にある内因性AChが代謝型ムスカリン性ACh受容体（mAChRs）を介して腸幹細胞の分化・増殖、維持機構に関与することを突き止めた。さらに、「多段階質量分析イメージング」（MS/MS測定）を応用することにより、ごく微量のAChを腸組織切片から直接検出し、腸上皮組織にAChが分布していることを初めて可視化することに成功した。本研究により、非神経性AChが細胞分化、組織形成に関与しているという今までほとんど研究のターゲットにされなかったAChの新規生理学的役割をin vitroで明らかにすることに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】26462318 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ADAM10 / 骨・軟骨代謝 / シェディング / Notchシグナル / 破骨細胞分化 / 細胞分化 / Notch / シグナル伝達 / 発生・分化

【研究成果の概要】

本研究では膜型メタロプロテアーゼADAM10による骨・軟骨形成および破骨細胞分化の制御機構を明らかにすることを目的とした．軟骨特異的にADAM10を欠損させたマウスの解析から，軟骨細胞の最終分化にADAM10は必須であることが明らかとなった．また，骨芽細胞特異的にADAM10を欠損させたマウスの解析から，ADAM10を骨芽細胞で欠損させると血液中のTSLP濃度が上昇し重篤な皮膚炎を発症することが明らかとなった．さらに，ADAM10を欠損させた破骨細胞前駆細胞を用いた分化誘導実験から，ADAM10の基質であるNotchレセプターからのシグナルが破骨細胞分化を完全に抑制することが明らかとなった.

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】23592230 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ADAM10 / Notch / 骨代謝 / shedding / 造血 / シェディング / シグナル伝達 / 発生・分化 / 免疫学

【研究成果の概要】

ADAM10はNotch活性化に必須である酵素として有力視されている。我々はAdam10遺伝子欠損マウス（A10/Mx1マウス）を作出し、骨代謝におけるADAM10-Notchシグナルの機能解明を試みた。A10/Mx1マウスは骨髄系細胞・造血幹細胞の増加が認められ、G-CSF産生が亢進していることが明らかとなった。この結果からADAM10-NotchシグナルはG-CSF産生を負に制御し骨髄系細胞の増殖を抑制していることが示された。一方A10/Mx1マウスは破骨細胞前駆細胞が増加していること、成熟骨芽細胞が多数存在していることが明らかとなり、骨吸収だけでなく骨形成も亢進していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】22580097 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

きのこ / 光受容体 / 形態変化 / シイタケ / 子実体形成 / 光応答 / バイオインフォマティクス / 遺伝子発現 / 次世代型DNAシーケンサー / 遺伝子 / ゲノム / 応用微生物 / シグナル伝達 / 生体分子 / 農林水産物 / 発生・分化 / 子実体

【研究成果の概要】

きのこの子実体形成には光が必要である。シイタケの光受容体遺伝子 Le.cry は、担子菌初のクリプトクロム型光受容体をコードしていた。その産物Le.CRY の解析 の結果、青色光領域を吸収し子実体形成に関わることが示唆された。プロテオーム解析の結果、 リン酸化や糖鎖付加などの翻訳後修飾を介して、子実体形成に関わる代謝経路やシグナル伝達 経路が存在することが分かった。トランスクリプトーム解析の結果、光応答遺伝子群を網羅・ 同定した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】21791004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生 / 循環器 / シグナル伝達 / 発生・分化 / 再生医学 / 循環器・高血圧 / 動物

【研究成果の概要】

イノシトール三リン酸受容体(IP3R)の3種のサブタイプのうち、1型および3型IP3Rを同時に欠損させたダブルノックアウト(1/3DKO)マウスは心臓血管発生異常をきたす。組織マーカーの発現解析と組織特異的1/3DKOマウスの解析により、1型・3型IP3Rは、右心室から心臓流出路の発生において二次心臓領域のうちTbx1非発現領域で機能すると考えられた。さらに、血管内皮細胞に発現する1型・3型IP3Rは、血管発生において血管新生の過程に必須の役割を担うことが示唆された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】20670002 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カルシウム / リン酸化 / 突起伸展 / シナプスから核へのシグナリング / 脳・神経 / 発生・分化 / 遺伝子 / シグナル伝達 / 生体分子

【研究成果の概要】

「経験」に基づく情報を、神経回路内に長期的に「書き込む」シグナル伝達機構については多 くの謎が残っている。本研究課題を通じ、(1)神経突起の形態制御を司る新たなCaMKK-CaMKカスケード、(2)シナプス活動が新規遺伝子発現を引き起こすメカニズム、(3)神経活動によって誘導され た遺伝子産物がシナプスを修飾する逆シナプスタギング機構、等を解明し、「経験」が神経情報 として神経回路に貯蔵される仕組みを世界に先駆けて明らかにした。

【研究種目】若手研究(S)

【研究期間】2008 - 2012

【配分額】104,780千円 (直接経費: 80,600千円、間接経費: 24,180千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】20770153 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生・分化 / 細胞内シグナル伝達 / 骨代謝 / 破骨細胞 / アダブター分子 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

破骨細胞は、古い骨組織を吸収・破壊することで骨の代謝維持を担っており、細胞膜に存在するRANKと呼ばれる受容体タンパク質が刺激を受けると分化誘導される。本研究では、RANKにはタンパク質間の会合を安定化させる機能をもつアミノ酸配列が存在すること、人工的に調製したそのアミノ酸配列は、破骨細胞の形成を顕著に抑制することを発見した。これらの発見は、骨粗鬆症など破骨細胞の形成異常が関与する骨疾患への新たな治療法開発に貢献すると考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】20659059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

病理学 / 発生・分化 / シグナル伝達 / 癌

【研究成果の概要】

上皮-問葉細胞分化転換(EMT, epithelial-mesenchymal transition)は発生の過程などにおいて上皮細胞が問葉系細胞に分化するプロセスである。EMTの研究が近年急速に注目を浴びているに対し、逆のプロセスである間葉-上皮細胞分化転換(MET, mesenchymal-epithelial transition)についてはほとんど明らかとなっていない。我々は転写因子TTF-1の肺癌細胞に対するMET誘導促進作用を中心に研究を行った。その結果、TTF-1はE-cadherinの発現を促進するだけでなく、細胞の遊走性、浸潤能を抑制した。EMTの誘導には転写因子SnailやSlugが重要であることが明らかとなっているがTTF-1を発現している細胞でTTF-1をノックダウンするとSnailやSlugの発現上昇は見られなくなった。これらの作用はTTF-1のTGF-β-Smadシグナルに対する抑制作用によるものであることが、いくつかの実験から明らかとなった。さらにTTF-1を発現した肺腺癌をヌードマウスに移植し検討したところ、原発腫瘍の大きさがTTF-1の発現によって小さくなることが確認された。しかし,形態学的な変化や転移能については明らかな差違は認められず,実験モデルの検討を含めて今後の研究が必要と考えられた。また本研究により、TTF-1自体に細胞増殖抑制作用があり、TGF-β-Smadシグナルを介さないシグナルの重要性も示唆されたことから,今後、METの新たな誘導因子として本プロジェクトを継続して行く予定である。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2008

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】呼吸器内科学

【研究領域課題番号】20790580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / シグナル伝達 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 発現制御 / 発生・文化

【研究成果の概要】

EGF刺激によりTGF-βの細胞内シグナル伝達分子Smadファミリーのリンカー領域のリン酸化が誘導される。Smad結合タンパクPin1がこのリンカーリン酸化特異的にSmadに結合することを見出し、それがSmadのSmurf2ユビキチンリガーゼによるユビキチン化と分解を誘導し、TGF-βシグナルを抑制することを明らかにした。これにより線維化における重要なサイトカインであるTGF-βシグナルが癌細胞での様々なEGFシグナル異常により制御を受ける一つのメカニズムが示唆された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】20590275 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

鰓弓形成 / エンドセリン-1 / Dlx5 / Dlx6 / non-cording RNA / 発生・分化 / シグナル伝達 / エンドセリン / 6 / 鰓弓

【研究成果の概要】

顎顔面の形態形成においてエンドセリン-1(ET-1)/ETA受容体シグナルは上顎・下顎の領域決定を支配する。鰓弓においてはDlx5/6の発現とDlx5/6遺伝子座に含まれるnon-coding RNAであるEvf2の発現はET-1に依存し、Evf2はさらにDlx5/6遺伝子の発現を負に制御する。一方、Dlx5/6遺伝子間領域のmI56エンハンサー活性は、Dlx5/6自身によって正の制御を受ける。これらの結果から、ET-1/ETARシグナルによるDlx5/6の発現誘導は、一部にはEvf2やmI56エンハンサーを介した正負のフィードバックループを介している可能性が示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】19300126 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脳・神経 / 発生・分化 / 遺伝子 / シグナル伝達 / 生体分子

【研究成果の概要】

Rho依存的アクチン制御ならびに神経活動依存性アクチン再編成と、神経回路網のダイナミックな機能再構築との間の関係については、まだ未解明な点が多い。そこで本研究計画においては、大脳皮質細胞、および小脳プルキンエ細胞の突起形態形成においで、活動依存性Ca^<2+>流入と低分子量G蛋白・アクチンシグナル経路がどのようにクロストークするか、という点を集中的に明らかにする。
これまでの研究に引き続き、本年度に入ってから、特に以下のことを明らかにした。
1.大脳皮質細胞において、膜挿入型CaMKであるCLICK-III/CaMKIgammaのアイソフォームの形態形成能を探索したところ、細胞質局在型のCaMKIα依存的に軸索形態の変化が制御されることを明らかにした。さらにこの形態変化の上流に位置する神経細胞形態誘導因子を複数同定し、各々の下流で活性化される低分子量GTPaseを明らかにした。本成果は、Ageta-Ishihara et al.として投稿準備中である。
2.海馬錐体細胞形態形成過程においては、アクチン制御が神経活動によって発生するカルシウム流人と相加的に作用することを先に報告したが、小脳プルキンエ細胞樹状突起においては、全く逆に、活動依存的Ca^<2+>流入とアクチン重合活性化が拮抗的に働く可能性を見出した。
この段階で、平成20年度若手研究(S)が採択されたため、本研究課題を廃止することとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】19,370千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 4,470千円)

【研究分野】発生生物学

【研究領域課題番号】19657065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生・分化 / シグナル伝達 / 小型魚類 / プロドラッグ

【研究成果の概要】

生体内の細胞または細胞集団の働きを解析しようとする場合、細胞を取り除く実験が有効な解析法となる。レーザーを用いて物理的に細胞を殺すと方法や、遺伝子工学的な方法によりトキシン遺伝子を発現させる方法などが行われてきたが、信頼性の高い簡便な方法は確立していないのが現状である。本研究ではニトロリダクターゼ酵素(NTR)とプロドラッグを利用して、細胞集団を発生中や発生後の任意の時期に除去できる新たな方法の構築と応用を検討した。
H19-20年度の研究で、To12ベクターにNTRと蛍光タンパクとの融合遺伝子と、さらにプロモーターとしてefl alpha, eql (equinatoxin-like),dlx5a,junb, ilf2の5つの遺伝子の5'領域を組み込み、NTR融合遺伝子を発現するゼブラフィッシュ系統を作製した。プロモーターはいずれも再生中のひれの組織で発現増加が見られる遺伝子である。作製したトランスジェニックを用いて、プロドラッグmetronidazoleを水中に投与し、蛍光を発する細胞数の変化とアポトーシス、さらに再生阻害によって評価を行った。Tg(ilf2:NTR-EGFP)において、2-5mMのプロドラッグで蛍光の減少と再生阻害が見られたものの、その他については、期待したほどの十分な作用が検出できなかった。この理由は、1)5'上流域だけでは充分に強い遺伝子の発現をドライブできない、2)再生中組織は常に速い速度で細胞が供給され、細胞除去の効果が明瞭にならないなどの原因が考えられるが、本研究で構築したベクターと条件は、分化した細胞を標的としては充分に機能すると考えられ、今後、生体内の分化細胞を標的とした除去を試みていく。また、本年度は、遺伝子周囲を広く含むBACにEGFPとさらにTo12配列を組み込んだTO12-BACの作製も進めており、現在、系統の確立を進めている。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】19209009 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 病理学 / 発生・分化 / 癌 / リンパ管新生 / 転写因子 / 転移 / 免疫 / シグナル亢進

【研究成果の概要】

我々はリンパ管新生の制御機構を明らかにするためにリンパ管新生のマスター因子Prox1の作用を中心に研究を行った。我々はTGF-βシグナルによってProx1の発現が抑制され, HoxD8によって発現が誘導されることを見いだした。また、Prox1がEtsファミリーの転写因子や核内受容体COUP-TFII1と結合し,リンパ管新生に重要な働きを示すことを明らかにした。さらにProx1の標的遺伝子として新たにFoxC2、Ang-2、HoxD8を見いだした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】49,530千円 (直接経費: 38,100千円、間接経費: 11,430千円)

【研究分野】生理学一般

【研究領域課題番号】19890273 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 発生・分化 / 破骨細胞 / カルシウムシグナル

【研究成果の概要】

申請者はIP3R結合タンパク質の一つであるIRBITをノックダウンすると破骨細胞分化因子RANKLによって誘導されるカルシウムオシレーションの始まるタイミングが早まる傾向があることを見いだした。この結果より、IRBITが破骨細胞分化誘導時のカルシウム動態に深く関わっている分子であることが明らかとなった。そこで、破骨細胞分化時、および未分化時にそれぞれ特異的にIRBITに結合するタンパク質のスクリーニングを行い、現在はその中の候補タンパク質の一つであるE3ユビキチンリガーゼに注目し、研究を進めている。

【研究種目】若手研究(スタートアップ)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,075千円 (直接経費: 2,670千円、間接経費: 405千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】19790740 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生 / 血管 / 咽頭弓 / カルシウム / 発生・分化 / シグナル伝達 / 再生医学 / 循環器・高血圧 / 血管発生 / 咽頭弓発生 / カルシウムシグナル / イノシトール三リン酸受容体 / 遺伝子工学

【研究成果の概要】

小児循環器診療の中で、先天性心疾患に合併して比較的頻度高く認められる大動脈の異常は、咽頭弓・血管系および咽頭弓動脈の発生異常から起因すると考えられる。本研究では、遺伝子改変マウスによる個体レベルでの解析や内皮細胞を用いたin vitroの解析によって、咽頭弓、血管系および咽頭弓動脈の発生に、イノシトール三リン酸受容体を中心とした細胞内シグナルが必須であることが示された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,630千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 330千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】19659065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脳・神経 / 発生・分化 / 遺伝子 / シグナル伝達 / 生体分子

【研究成果の概要】

細胞は試験管とは異なり、化学反応が局所的におこる。自由拡散している酵素と基質が確率的に出会うのではなく、数十nm四方の「ミクロドメイン」に濃縮された関連分子の間で効率よくシグナルが共役・伝達されている。然るに、この「マイクロドメイン」内における代謝反応論・酵素学はこれまでほとんど明らかにされていない。
本研究では、神経可塑性発現や神経回路形成に際し、膜ミクロドメインや微小突起レベルで制御される蛋白リン酸化反応が必須であることを手がかりに、単一シナプスおよびその近傍において生じるリン酸化反応を定量し、また突起制御に貢献する蛋白蛋白相互作用を可視化し、さらにウィルスベクター等を応用し、多数の酵素反応を同時定量したり、細胞種特異的定量を可能にする基盤技術の創成を試みる。このような計画に基づき、以下のような基盤技術を確立した。
1.CaMKIgamma/CLICK-IIIの膜状自己凝集化をFRETによって有意に検出することに成功した。本成果は、Takemoto-Kimura, et. al.としてNeuron誌に発表した。
2.単一シナプスを刺激して、その近傍でCa2+上昇やキナーゼ活性上昇などをリアルタイムで可視化するUV uncaging FRETシステムを完成させた(Fujii, et. al.投稿準備中)。
3.京都大学工学部森研究室との共同研究で、アクティブゾーン蛋白RIMlaと電位依存性カルシウムチャンネルのシナプス終末における共局在を定量することに成功した(Kiyonaka, et. al.Nature Neurosci. 2007)。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2007

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】18650101 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脳・神経 / 発生・分化 / 遺伝子 / シグナル伝達 / 生体分子

【研究成果の概要】

本研究を通じ、神経可塑性を担うシグナル分子が、シナプス蛋白複合体内で、あるいは単一スパインや単一シナプス近傍にて、どのように挙動するかを可視化・定量測定する新規技術を開発することを試みた.
まず樹状突起スパインに存在するCaMKIIとその類縁キナーゼについて、スパインやミクロドメイン内相互作用を検出できるFRETプローブ作成を行った。その結果、脂質ラフト近傍におけるCLICK-III/CaMKIgammaの分子間相互作用やCaMKIIとArcのスパイン内相互作用を定量的に計測することに成功した(Takemoto-Kimura et al.改訂中).また、PSD局在が報告されているにCaMK類似キナーゼがCREB転写を抑制的に制御する機構を明らかにした(Ohmae et al.,J. Biol. Chem.2006).さらに、プルキンエ細胞スパインにおけるアクチン動態の可視化を実施し、これに基づき新たな制御因子の探索を実施した(Fuse et al.準備中).
共同研究においては、我々の開発したEGFP-actinプローブを用い、東京医科歯科大学岡部繁男研究室と共同で、アクチン線維と興奮性シナプス機能分子複合体の相互作用を単一スパインレベルで解析した。(Kuriu et al. J. Neurosci.,2006).一方、シナプスでのカルシウムチャンネル局在制御について京都大学工学部森泰生研究室と共同で探索し、RIM1がカルシウムチャンネルとの相互作用により、プレシナプスへ集積する機構を明らかにした(Kiyonaka et al. Nature Neurosci. inpress).

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2006

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】18770169 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 骨疾患 / 破骨細胞 / サイトカインレセプター

【研究成果の概要】

骨吸収を担う破骨細胞の分化・活性化は、受容体RANK及びそれに結合するアダプター分子TRAF6によって制御されるが、RANK/TRAF6シグナルの分子機構には不明な点が多い。申請者は、昨年度の本研究課題において、TRAF6シグナルの増強を担い、破骨細胞分化誘導に必須であるRANK細胞質領域を発見した。本年度は、この領域の欠損RANK変異体を用いた解析及びこの領域への結合因子の同定を行うことにより、RANKによるTRAF6シグナル増強機構の解明を試み、以下の成果を得た。
RANKのTRAF6シグナル増強領域を欠損させると、刺激初期における転写因子NFκBの活性化には影響がみられないが、野生型RANKで観察される長期にわたるNFκB活性化が消失した。さらに、野生型RANK及び欠損変異体の細胞内での局在を解析したところ、野生型RANKでは刺激後、細胞膜上から細胞内に取り込まれエンドソームに局在するのに対して、欠損変異体ではエンドソームに移行せず細胞膜上に局在したままであった。一方、TRAF6シグナル増強領域に結合する因子を、既知の破骨細胞形成制御因子の中から免疫沈降法により探索したところ、幾つかの結合因子を同定することができた。これらの結果から、RANKのシグナル増強領域は幾つかの結合因子を介してRANKのインターナリゼイションを促進させることで、TRAF6シグナルの増強を担っている可能性が示唆された。このことは、受容体の局在の変化がシグナルめ質を決定することを示しており、破骨細胞形成の分子機構の解明に新たな知見を与えるだけでなく、骨疾患治療における新しい分子標的の候補の発見に繋がると考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】18390150 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

免疫学 / シグナル伝達 / 発現制御 / 発生・分化 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

免疫システムにおける自己-非自己識別機構の人為的な制御は自己免疫疾患の治療、移植免疫寛容誘導、癌免疫誘導など様々な臨床的応用に期待できる。申請者は、胸腺髄質上皮細胞の分化とそれによる自己免疫寛容誘導の分子メカニズムを解明し、自己免疫疾患治療や癌免疫誘導の新規方法論を創造することを目指している。申請者は既にTRAF6が胸腺ストローマ依存的な自己免疫寛容の誘導に必須であることを証明した。本研究課題では胸腺ストローマにおけるTRAF6依存性シグナルの標的分子および上流のレセプターとリガンドを同定し、それら分子の自己免疫寛容への関与を検証することを目的とした。
胸腺ストローマにおけるTNFレセプターファミリーの発現を半定量的RT-PCRで網羅的に解析し、TRAF6の上流レセプター候補としてRANKとCD40を得た。各レセプター単独の欠損ではTRAF6欠損マウスの表現型より緩和であるため、TRAF6の上流レセプターとしては不十分であった。しかし両者を欠損するマウスを作製し、解析することでRANKとCD40の両者が協調的に機能することで胸腺髄質上皮細胞を分化させ、その結果自己免疫寛容を誘導すると結論した。さらにRANKやCD40のリガンドは未熟な髄質上皮細胞を含む胸腺ストローマin vitroで分化誘導に十分であった。この実験系を用いて、RANKとCD40の下流にTRAF6やNIKが存在することを証明し、当初の目的であった「胸腺髄質上皮細胞の分化を誘導するTRAF6の上流レセプターの同定」を完遂した。さらにマイクロアレイ法によりTRAF6シグナルの標的遺伝子を決定した。これらは、胸腺依存的な自己免疫寛容の誘導機構の理解において重要な結果であると考える。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】16,490千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 1,590千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】18390409 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 発生・分化 / 骨代謝 / 創薬 / 骨転移 / リウマチ / 骨粗鬆症

【研究成果の概要】

これまでにヒトCD40の細胞外領域および膜貫通領域にマウスRANKの細胞質領域を融合させたキメラ受容体(h40/mRK)による破骨細胞形成実験系を確立し、それを用いた実験結果から、RANKの細胞質領域の特定部位にTRAF6シグナルを増強する因子が作用するか、その特定部位が直接TRAF6シグナルを増幅するという仮説を提唱した。また、種々の欠損変異を導入したキメラ受容体の機能解析を行い、TRAF6結合配列以外の種問で強く保存された特定領域HCRを欠損させると刺激依存的なNFkBやMAPKの活性化が正常に起こるにもかかわらず、破骨細胞も形成されないこと、またこのHCRをCD40の細胞質領域に融合させると破骨細胞の形成能を獲得することが明らかにした。本研究ではHCRがシグナルに及ぼす影響及びその作用機構を解析した。RANKシグナルでは、TRAF6を介したシグナルがITAMモチーフを持つ膜受容体に作用することによりPLCγ2のリン酸化やCa2+濃度の変化が起こりNFATが活性化されると考えられている。特定領域を欠失した受容体では、そのPLCγ2のリン酸化やNFATの発現が一過性であるのに対して野生型キメラ受容体や特定領域を付加したCD40では、それらのシグナルが持続的に維持されることを見出した。さらにHCRに結合するタンパク質の同定に成功し、それらがHCRの不活性型変異体には結合しないこと及びRANKシグナルによる破骨細胞形成に関与することを示した

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】17,620千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 2,220千円)

【研究分野】呼吸器内科学

【研究領域課題番号】18790555 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / シグナル伝達 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 発現制御

【研究成果の概要】

転移性肺癌モデルにおけるE3リガーゼノックダウン効果の検証:作成したmiRNA発現レンチウイルスベクターを用いて、MDA-MB231細胞株でE3リガーゼSmurf2及びSmurf1の安定的なノックダウンをウェスタンブロッティングで確認した。これらのE3リガーゼは受容体をユビキチン化・分解してTGF-βシグナルを抑制することが報告されているが、ノックダウンが同細胞で実際にシグナルに影響するか否かを標的遺伝子発現やシグナル伝達分子Smadのリン酸化レベルで確認した。その結果一方のE3リガーゼのノックダウンによって予想外に他のE3リガーゼの蛋白量が増加すること、シグナルへの影響が一方で認められないことが明らかとなった。この点について更なる解析を行い一方のE3リガーゼが別のE3リガーゼをユビキチン化・分解していることを初めて見出し発表した。
肺癌モデルにおけるE3リガーゼの効果の検証:前年度の肺腫瘍細胞での検討に加えてマウス肺組織でのArkadiaをはじめとしたE3リガーゼの発現をRT-PCRで確認した。合わせて既に同定していたArkadia結合蛋白RB1CC1が同様に肺組織で発現していたことに注目し、ArkadiaのTGF-βシグナル増強作用へのRB1CC1の役割を解析し報告した。またArkadiaの新たな基質としてがん遺伝子c-Ski/SnoNを同定し報告した。今後肺癌モデルでのこれらの知見を踏まえた上でのさらなる検討を計画している。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】17207011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞周期 / シダナル伝達 / 卵減数分裂周期 / 卵成熟誘起ホルモン / 受精 / 前核 / ゲノム継承 / シグナル伝達 / DNA複製装置 / 発生・分化 / 核構築 / 卵成熟

【研究成果の概要】

世代交代に際してゲノム継承を実現していく分子機構を解明するために、卵細胞における細胞周期制御に至るシグナル伝達と核構築制御を解析した。
1.[卵減数分裂の再開始]ヒトデ卵成熟誘起ホルモン(1-MeAde)の卵表受容体の単離同定をめざした。1-MeAde誘導体を結合させたアフィニティー・フェライトビーズに特異的に結合するタンパク質を、卵膜の可溶化画分から3種(p42、p92、p97)得た。これらは、抗体等を用いた解析から、受容体を構成している可能性が高い。
ヒトデ卵減数分裂周期について、Auroraを解析した。ヒトデAuroraはCdc2の下流で活性化し、一タイプしか存在しないが、脊椎動物で見られる複数タイプの機能を担うことをHeLa細胞を用いて示した。
2.[卵減数第二分裂中期の停止と解除]アフリカツメガエル卵は、減数第二分裂中期に停止して受精を待つ。この停止では、Mos-MAPK経路の直下にあるp90Rskが、Erp1を直接リン酸化して安定化させるとともにそのAPC/C抑制活性を亢進させ、それによってサイクリンBのタンパク分解を阻止していることが判明した。一方、この停止の解除には、従来報告されていたCaMKIIだけでなく、同時にカルシニュリン(CaN)も一過性に活性化する必要のあることを示した。
3.[核構築]アフリカツメガエル未成熟卵では、importin αに依存した核輸送が抑制されており、これはimportin αがannulate lamellaeにトラップされているためであることが判明した。このimportin αのトラップは卵成熟開始とともに解除され、それと、卵成熟による前核形成能の獲得との関連が考えられる。受精後の雌雄両前核の接近と融合については、ヒトデ卵を用いて、細胞周期の進行は必要でないことを示した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】49,140千円 (直接経費: 37,800千円、間接経費: 11,340千円)