【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】17K08286 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

慢性骨髄増殖性腫瘍 (MPN) / JAK2V617F変異体 / エリスロポエチン受容体 (EpoR) / STAT5 / ＣＩＳ / チロシンリン酸化 / JAK2変異体 (V617F) / リン酸化 / CIS / 慢性骨髄増殖性腫瘍 / エリスロポエチン受容体 / トロンボポエチン受容体 / STAT3 / ERK / Akt / EpoR / EpoR結合分子 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

チロシンキナーゼJAK2の点変異体 (V617F) が慢性骨髄増殖性腫瘍 (MPN) の原因遺伝子として同定されたが、JAK2の点変異がMPNを発症するメカニズムには不明な点が多い。本研究では、JAK2変異体が誘導する形質転換には、エリスロポエチン受容体 (EpoR)の共発現が必須であることを見出した。また、EpoRのY343、Y460, Y464の3個のチロシン残基のリン酸化が、転写因子STAT5のリン酸化を介して、顕著な発がんシグナルを誘導することを明らかにした。一方、EpoRのY401のリン酸化は、抑制因子CISが結合し、JAK2変異体による発がんシグナルを負に制御することを見出した。

【研究の社会的意義】

本研究において、チロシンキナーゼJAK2の変異体が誘導するエリスロポエチン受容体 (EpoR) を介した発がんシグナルを解析することにより、慢性骨髄増殖性腫瘍 (MPN)の発症機序の解明へと繋がった。EpoRのY343、Y460、Y464のリン酸化は、STAT5を介した発がん誘導機構に必須であるのに対して、EpoRのY401のリン酸化は、CISとの結合を介して、発現シグナルに抑制的に機能することを見出した。本研究成果は、MPNの治療標的分子の同定へと繋がることが期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】20790719 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小児腎 / 泌尿器学 / 腎臟 / 蛋白尿 / 糸球体上皮細胞 / Nephrin / TRPC6 / 腎臓 / チロシンリン酸化 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

腎糸球体濾過機能におけるバリアー機能は糸球体上皮細胞間の細胞接着装置であるスリット膜構造が担っている。最近ではNephrinやNeph1といったスリット膜を構成する蛋白質が同定され、その分子構造が明らかになってきており、さらにNephrinやNeph1がその細胞内領域がチロシンリン酸化により修飾を受けることが報告されている。本研究ではプロテオミクス技術を用いてNephrinのリン酸化によって制御されるスリット膜構造のダイナミクスを網羅的に解析し、それが糸球体上皮細胞の機能、構造にどのような影響をあたえるか、さらにNephrinを発端とするシグナル伝達系の破綻がいかに蛋白尿の発症に関わっているかを検討した。その結果Nephrinの細胞内領域のチロシンリン酸化によりPLC-γ1を含む種々のアダプタータンパク質が細胞膜表面にリクルートされ、Nephrinがカルシウムシグナル等のシグナル伝達を行うプラットフォームとして機能する機構が明らかになった。これらの結果は糸球体上皮細胞のバリアー機能を担うシグナル複合体としてのスリット膜の新たな役割を提示するものとなった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】12480209 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Rasタンパク質 / H-Ras / N-Ras / K-Ras / シグナル伝達 / 長期増強 / 海馬 / ノックアウトマウス / Ras / NM-DA受容体 / ハックアウトマウス / トランスジェニックマウス / チロシンリン酸化 / H-ras / K-ras

【研究成果の概要】

Rasタンパク質は、細胞増殖、細胞形態、細胞の生存等に関連したシグナル伝達に重要な役割を果たしている、しかし、生体での生理的機能については明らかでなく、我々は3種類すべてのras遺伝子ノックアウトマウスを作製し、その解析を始めた。増殖因子刺激に対する細胞内シグナル伝達でのRasタンパク質の重要性からは予想されなかったことであるが、H-ras(-/-)マウス、N-ras(-/-)マウスおよび2重欠損マウスは見かけ上、正常に発生、発達し、明らかな解剖学的異常は見いだされなかった。ところが、H-ras(-/-)マウスの中枢神経系では、グルタミン酸受容体の一種であるNMDAチャンネルのチロシンリン酸化の亢進による活性化、および海馬長期増強の上昇が起こっていた。またRasタンパク質がEGF, FGFなどを初めとする成長因子の受容体を介するほかに、NMDAからのシグナルも伝達していることを明らかにした。このようにRasタンパク質は、発生途上もしくは成体で、様々な外界からの刺激に応答する際に重要な働きをしていることが強く示唆された。一方では、K-rasノックアウトマウスで、心筋細胞の増殖異常や前角ニューロンの細胞死等が起こり、従来から考えらていた細胞増殖や細胞の生存へのRasの関与を裏付ける結果も得た。これまで確立された培養細胞株を用いた実験は、多くの細胞で見られる最大公約数的なRasの機能を明らかとしてきたが、rasノックアウトマウスの解析から、我々は細胞外からの刺激に対する細胞内情報伝達経路の集約点の一つであるRasの機能について、発生の時期、特定の臓器、特定Q細胞で、個別のシグナルに対して検討し、海馬の神経細胞では、NMDA受容体から、p38を通り、さらにその下流にRasが位置しており、p38の死のシグナルをRasの生存シグナルで細胞死を止めていることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】12470348 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / シグナル伝達 / チロシンリン酸化 / Srcキナーゼ / ヒストンアセチル化 / レドックス / シグナル伝達経路 / 分化 / 性ステロイドホルモン / 脱落膜 / チロシンキナーゼ / c-Src

【研究成果の概要】

本研究では、子宮内膜の多様な機能発現を担う細胞内シグナル伝達経路の解明を目的として、チロシンリン酸化、ヒストンアセチル化、酸化還元(レドックス)反応について検討し、以下の点を明らかにした。
1.リン酸化:内膜分化(脱落膜化)系において、種々の蛋白のリン酸化状態が変化すると同時に、src familyチロシンキナーゼのひとつであるc-Srcが活性化していた。活性化型c-Srcを認識する抗体clone 28を用いることにより、ヒト子宮内膜及び脱落膜において、分化に伴って活性化型の発現増強を検出した。次にsrc familyチロシンキナーゼの阻害剤を用いたところ、逆説的にc-Srcは活性化し、分化も促進された。阻害剤の特異性の限界を鑑み、c-Srcの野生体および一部の変異体を発現するadenovirusを作製し、内膜細胞に感染させてその発現を確認した段階である。一方、2次元電気泳動法によりチロシンリン酸化蛋白を網羅的に解析し、分化特異的なリン酸化スポットを約20種類同定した。また、齧歯類の脱落膜化においても、活性化型の発現が増強しており、現在c-Srcノックアウトマウスの内膜分化能を検討中である。
2.ヒストンアセチル化:脱アセチル化酵素阻害剤の内膜分化への影響を検討したところ、細胞・薬剤特異的に性ステロイド依存性分化を促進した。その際、一部のコアヒストンの特定の部位がアセチル化されていた。
3.レドックス反応:内膜の増殖・分化の際、レドックス環境を調節するチオレドキシンが誘導された。分化過程では細胞外へ放出され、paracrine/autocrineに増殖を調節する可能性が示された。
内膜機能発現には、様々な蛋白修飾を通じたシグナル伝達経路の活性化が重要であることが示唆された。雌性生殖器官疾患に対して、シグナル伝達を標的にした創薬および治療開発の可能性を示唆する研究成果が得られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】16,600千円 (直接経費: 16,600千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】10557038 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / チロシンりん酸化 / インターフェロン / SH2ドメイン / シグナル伝達 / APS

【研究成果の概要】

我々は活性化型c-kitやc-fmsを用いたtwo-hybrid法によって新規チロシンキナーゼ基質のスクリーニングを行い、これまでにAPS、STAP-1,2などの新規分子をクローニングした。さらに今回SH2ドメインなどを持たない全く新しいタイプの基質WARSを単離した。本分子にはショウジョウバエでRas-MAPキナーゼ抑制系に働くことが明らかにされているある分子に類似したドメインを有する。非常に興味深いことにWARSの強制発現によってEGFによるRasの活性化が抑制された。今後各種がん細胞での発現を調べ、本遺伝子を強制発現させた場合の造腫瘍能や転位能について調べる。さらにノックアウトマウスを作成して生理機能を明らかにする予定である。
さらに酵母two-hybrid systemによってJAK2のキナーゼドメインと直接結合しそのキナーゼ活性を抑制する分子JAB(JAK-binding protein)を見い出した。JABはJAK2のチロシンキナーゼドメインに直接結合し、その活性を抑制することを見い出した。JABの生理機能を明らかにするためにJABノックアウトマウスを作成した。JABノックアウトマウスは正常に生まれてくるが生後3週間以内に全て死亡し、胸腺、脾臓の萎縮と肝臓での脂肪の蓄積および多くの組織での炎症様の単球の侵潤が見られた。これらの表現型の一部はIFNγトランスジェニックマウスに似ている。実際JAB-/-マウスとIFNγ-/-マウスとのかけあわせによって症状が全く見られなくなった。しかしそればかりでなくRag2-/-マウスとのかけあわせによっても症状は消失した。さらにJAB-/-マウスの骨髄細胞をJAK3-/-マウスに移植するとリンパ球は再構築されるもののやがてマウスは死亡した。したがってJAB-/-による個体の死はT細胞とインターフェロンγに依存することが示された。JABはT細胞においては活性化を抑え、非リンパ系細胞ではIFNγ感受性を決める分子であることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】12,300千円 (直接経費: 12,300千円)

【研究分野】人体病理学

【研究領域課題番号】09470056 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

βカテニン / 増殖因子受容体 / シグナル伝達 / 細胞接着分子 / がん浸潤 / チロシンリン酸化 / 細胞接着因子

【研究成果の概要】

がん浸潤におけるβカテニン-増殖因子受容体間結合とシグナル伝達機構を明らかにする目的で、βカテニンにおける増殖因子受容体との物理的結合部位を明らかにすると同時に、実際のがん組織を用いて、βカテニンを介した増殖因子受容体かたのシグナル伝達機構の臨床的意義を検討した。本研究において以下のことが明らかになった。
1.ヒトがん細胞を用いた検討により増殖因子刺激によりβカテニンがチロシンリン酸化されることが示された。また、ヒトがん細胞においても、細胞間の解離した低分化がんならびに浸潤先進部でβカテニンが強くチロシンリン酸化されていることが示された。
2.βカテニンの増殖因子受容体との結合部位を同定を試み、βカテニンの中央に存在するアルマジロ反復配列の12番目の反復配列と結合することが明らかとなった。同部位は上皮増殖因子による刺激でリン酸化されることにより、増殖因子受容体からのβカテニンへのシグナル伝達機構が存在することが明らかになった。
3.βカテニンの増殖因子受容体との結合部位のチロシンリン酸化ペプチドを用いて、βカテニンチロシンリン酸化抗体を作製した。本チロシンリン酸化抗体を用いた検討により、増殖因子受容体からのシグナル伝達機構はβカテニンをチロシンリン酸化し、βカテニンとαカテニンとの結合を解離させることによりカドヘリン細胞接着機構の阻害を来していることが示された。
4.実際のヒトがん組織を免疫組織化学的に検討すると、ヒト大腸がんの浸潤先進部においてがん細胞ががん腺管から解離し浸潤する部位で強くβカテニンのチロシンリン酸化が認められていることが示され、実際のがん浸潤に増殖因子受容体-βカテニンシグナル伝達機構が重要な役割を果たしていることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】8,400千円 (直接経費: 8,400千円)

【研究分野】人体病理学

【研究領域課題番号】07407007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞接着 / 浸潤・転移 / カドヘリン / カテニン / インテグリン / チロシンリン酸化 / c-erbB-2 / シグナル伝達 / がん間質相互作用 / 多段階発がん / カドヘリン・カテニン / DNAメチル化

【研究成果の概要】

E-cadherin発現異常ががん患者の予後と相関することを確認し、がん細胞においてはE-cadherin遺伝子のプロモーター領域のCpGメチル化が発現低下の要因の一つとなる可能性を示した。瀰漫型胃がん細胞には第16染色体LOHならびにE-cadherin遺伝子変異を見いだした。Cadherin裏打ち蛋白であるα-ならびにβ-cateninについても検討し、E-cadherinがん浸潤抑制系が、E-cadherinならびに裏打ち蛋白の発現異常・遺伝子変異あるいはチロシンリン酸化といった多様な機構によって不活化されていることを示した。
β-cateninのチロシンリン酸化をもたらすキナーゼを探索し、β-cateninとc-erbB-2蛋白の直接相互作用を証明した。大腸がん浸潤先進部でβ-cateninの強いチロシンリン酸化を認め、細胞接着系と受容体型チロシンキナーゼ系のクロストークが、ヒト個体のがん浸潤先進部で実際におこっていることがわかった。β-cateninのamadillo repeatのうちカルボキシ末端側120アミノ酸の範囲にβ-cateninとc-erbB-2蛋白の結合ドメインが存在することがわかった。欠失変異型β-cateninをがん細胞に導入し、内因性野生型β-cateninとc-erbB-2蛋白の結合阻害すると、細胞間接着性は強固になり上皮性形態を回復し、ヌードマウス移植モデルでは腹膜播種や肝転移が抑制されていた。
欠失変異型β-catenin導入細胞では、integrinβ4発現が誘導されていたことから、E-cadherin細胞接着系とintegrin系のクロストークの可能性の検討をin vitroで開始した。Integrin系がpaxillinのチロシンリン酸化を介してE-cadherin細胞接着系に影響し、細胞間接着性の減弱、接着斑形成および細胞の進展などを惹起する可能性があると考えられた。膀胱がんの特徴的な上皮内進展には、integrinβ4の発現低下とそれに基づくlaminin上での運動能の亢進が関与していると考えられた。Integrinβ4の転写調節機構の解明のためにプロモーターを含む転写調節領域を同定した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,300千円 (直接経費: 36,300千円)