【研究領域課題番号】21H02422 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

高浸透圧 / MAPキナーゼ経路 / リン酸化 / 酵母 / 出芽酵母 / シグナル伝達 / MAPキナーゼ / キナーゼ / センサー

【研究成果の概要】

本研究では、酵母の高浸透圧応答性Hog1 MAPK経路で見出した高浸透圧による細胞質局在キナーゼのリン酸化増強作用の仕組みの解析を行なった。リン酸化増強の作用点として（1）Pbs2 MAP2K-Hog1 MAPK反応過程、（2） Ssk2 MAP3K-Pbs2 MAP2K反応過程の２つが存在する。特に（2）のリン酸化増強については仕組みが全く不明であるため、（2）に焦点を当てて解析した。まず、高浸透圧応答に必須な上流のSln1センサーの破壊株などを使った分子遺伝学的、生化学的解析から、このリン酸化反応過程が実際に高浸透圧増強を受けることを示した。またこの反応増強にSsk2と結合するレスポンスレギュレーターSsk1の特定の領域が必要なこともわかった。（2）の反応増強はPbs2のリン酸化を指標にしているため、現時点では高浸透圧により、Ssk2の活性が増強しているのか、Pbs2がリン酸化を受けやすくなっているのかがわからない。そこで、Ssk2の制御領域への系統的欠失変異の導入、Pbs2のランダム変異導入によって、高浸透圧によるリン酸化増強を模倣した変異体の単離を試みた。その結果、Ssk2、Pbs2両者で高浸透圧なしでも恒常的にHog1経路を活性化する変異体の取得に成功した。
高浸透圧によるPbs2リン酸化増強の理由として、リン酸化が高浸透圧で増強される可能性に加え、Pbs2の脱リン酸化が高浸透圧によって抑制される可能性も考えられる（Pbs2のリン酸化レベルはどちらの場合も上がる）。そこでPbs2の脱リン酸化に関わるホスファターゼを探索し、Ptc1を責任ホスファターゼの一つとして同定した。
以上より、（2）のリン酸化増強の仕組みの解明に向けて、本年度の研究で複数の手がかりを得ることができたと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】16H04761 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

高浸透圧 / 酵母 / MAP kinase経路 / センサー / シグナル伝達 / リン酸化 / 環境ストレス / MAPキナーゼ経路 / 高浸透圧応答 / センシング / MAPキナーゼ / 浸透圧 / 膜タンパク質 / HOG経路 / 高浸透圧センシング / 相互作用 / HOG MAPK経路

【研究成果の概要】

細胞が高浸透圧を感知する分子機構を明らかにするため、酵母の高浸透圧応答に働くHog1 MAPキナーゼ(MAPK)経路の高浸透圧センサーの研究を行い、Hog1経路には膜タンパク質型と非膜タンパク質型の高浸透圧センサーの存在することを明らかにした。前者については、高浸透圧感知・応答に必要な複数のセンサー膜タンパク質の複合体形成について、その相互作用部位を同定することに成功した。後者については、細胞質内のMAPKKによるMAPKリン酸化（活性化）を高浸透圧が増強する作用があることを見出し、細胞が環境ストレスに対して適切に応答する仕組みを明らかにした。

【研究の社会的意義】

本研究で明らかになった膜タンパク質型及び非膜タンパク質型の高浸透圧センサーを介した高浸透圧応答制御機構は、適切な環境ストレス応答を保障する仕組みとしてヒトなどの高等真核生物にも当てはまる可能性が高い。今後の検証を通じて、環境ストレス応答制御の全体像の理解や、環境ストレス耐性の動植物への付与技術の開発などに繋がることが期待される。また本研究で解明されたHog1 MAPKの制御機構に関する知見は、ヒトMAPKの制御破綻が引き起こす癌や自己免疫疾患といった疾患の治療法・治療薬の開発にも役立つと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】15H04703 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エピゲノム制御 / がん / ERK / MAPキナーゼ / CtBP / 転写制御 / シグナル伝達 / 遺伝子 / 癌 / 発現制御 / リン酸化 / 生体分子 / EMT

【研究成果の概要】

ERK経路は細胞増殖を司る情報伝達経路であり、その異常な活性化が発癌を導く。これまでにERKの基質として複数の分子が同定されているが、未知の基質も数多く存在すると考えられており、その解明は癌克服の観点からも重要である。本研究において我々は、ERK基質分子の網羅的な探索を行い、MCRIP1を始めとする複数の新規分子を同定することに成功した。さらに、ERKによるMCRIP1のリン酸化が、転写抑制共役因子CtBPの機能制御を介して、E-カドヘリンの発現と上皮間葉転換を調節していることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】24390079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ストレス応答 / p38 / JNK / p53 / 中心体 / MAPキナーゼ / MKK4 / がん / PLK / シグナル伝達 / SAPK

【研究成果の概要】

本研究では、DNA損傷等のストレス刺激によって活性化される2つのシグナル伝達経路、即ち、ストレス応答MAPK経路とp53経路が、協調してPLK4の活性を制御しており、ストレス環境下で中心体の複製を停止させて、染色体の安定性を保持する機能を持つことを明らかにした。さらに癌細胞で高率に観察されるMKK4（ストレス応答MAPKK）およびp53の機能欠損変異によって、中心体複製調節機構が破綻し、染色体の倍数体異常が惹起されることを見出した。本研究により、MKK4がストレス環境下でp53と協調して機能し、中心体の過剰複製と染色体不安定性を防御する新たなタイプの癌抑制遺伝子であることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】23659033 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ASK1 / 脂質 / ストレス応答 / シグナル伝達 / 線虫 / 緑膿菌感染 / MAP キナーゼ / MAPキナーゼ

【研究成果の概要】

ASKファミリーシグナルを解析する目的で、線虫におけるゲノムワイドスクリーニングを行った結果、55個のASKファミリー活性化候補因子を単離した。それらの分子に対して、神経細胞の分化、自然免疫応答、酸化ストレス応答などを中心とした解析を行った。また、既知のp38活性化経路との相対的な関係について解析を行った結果、遺伝子XがASK1の上流活性化因子であることを明らかにした。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】応用ゲノム科学

【研究領域課題番号】21310127 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

出芽酵母 / 機能ゲノム / 細胞周期細胞形態 / 画像解析 / 薬剤標的 / 細胞形態 / 細胞周期 / 細胞壁 / HOG / MAP kinase / シグナル伝達 / 紡錘体 / M期

【研究成果の概要】

研究代表者らは出芽酵母の細胞形態、アクチン、核などの形態に関する高次元表現型情報を集めることにより、遺伝子欠損によって変化する表現型プロファイルが遺伝子産物の機能に関係していることを発見した。このことをヒントにして高次元表現型データから表現型プロファイルを統計学的に抽出し、パターンの類似性からその条件下で影響を受けている遺伝子機能を推測する(表現型プロファイリング)法を確立した。この方法は、生理活性物質の細胞標的を推定できる新しい方法としても利用できる。犯罪捜査における容疑者プロファイリングと同様に、プロファイルの精度は統計的データの質と量に依存することから、観察対象の表現型を増やすことも試みた。これにより顕微鏡画像から得られる細胞周期や細胞構造の情報を主とする表現型を1,000以上のパラメータ(指標)から解析するシステムを構築できた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】21390090 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分子病態学 / 分子腫瘍学 / シグナル伝達 / MAPキナーゼ / ストレス応答 / がん / 蛋白質リン酸化

【研究成果の概要】

ストレス応答MAPK経路は、DNA損傷などの環境ストレス刺激によって活性化され、細胞のストレス応答の制御に中心的な役割を果たしている。また、この経路の制御異常が癌を始めとする難治性疾患の発症にも関与する。本研究ではストレス応答経路の主要なMAPKKKであるMTK1の生理機能の解析を行い、MTK1がサイクリンの発現を負に制御して増殖抑制に寄与することを見出した。またMTK1の新たな基質分子として特定のキナーゼ分子(Mip1と命名)を同定することに成功し、MTK1によって活性化されたMip1が、アポトーシス抑制する機能を持つことを見出した。また、癌細胞においてMip1の発現異常が起きていることを確認した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】20591286 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

母体低栄養 / シグナル伝達 / ネフロン数 / プログラミング / 腎発生 / MAPキナーゼ / 尿管芽 / カスパーゼ3 / 尿管芽細胞 / 細胞運動 / アポトーシス / βカテニン / PI3キナーゼ

【研究成果の概要】

母体低栄養ラットの腎サイズ、尿管芽分岐は胎生14日以降減少する。腎サイズは生後正常となるがネフロン数は減少している。母体低栄養腎において腎発生に重要なシグナル分子は胎生15日には抑制、胎生18日には活性化されていた。一方、アポトーシスの指標、活性型カスパーゼ3は両時期ともに母体低栄養腎で減少していた。カスパーゼ3阻害は尿管芽細胞の運動を抑制した。母体低栄養腎のネフロン数減少はカスパーゼ3を介する細胞運動の低下により尿管芽分岐が抑制されるためと推測される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】19370074 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞壁 / 出芽酵母 / 細胞周期チェックポイント / Rho1p / シグナル伝達 / 紡錘極体 / 細胞周期 / HOG / MAP kinase / 紡錘体 / M期

【研究成果の概要】

真核単細胞のモデルである出芽酵母を用いて、「細胞周期進行」という時間軸に添って細胞の形態形成が正しく起きるメカニズムを解明することを本研究の目的にした。そのためには、(1)細胞壁合成などの細胞形態形成がうまく行かない時に細胞周期を停止する機構と、(2)細胞周期進行とともに細胞の形態形成が起きる機構を明らかにすることが必要である。我々は細胞壁合成チェックポンとの研究を行い、複数の核移行の過程がこれに関与することを明らかにした。またG1/S 期のサイクリン依存性タンパク質リン酸化酵素が細胞形態形成の制御因子であるRho1p の活性化に直接影響を与えることを明らかにした。細胞の空間形成は、細胞の数や細胞の機能分化の制御とともに多細胞生物における多細胞集団の構築にとっても極めて重要な要素になっている。したがって、本研究計画で行った細胞周期と「細胞の空間形成」の連携に関する研究は、他の研究との有機的な結合により、真核細胞の運命を決める細胞周期についてより深い理解が得られるものであった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】19390081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

p38 / JNK / MTK1 / ストレス顆粒 / シグナル伝達 / ストレス応答 / MAPキナーゼ

【研究成果の概要】

ストレス応答MAPK経路(MAPKKK-MAPKK-MAPK)は、環境ストレスによって活性化され、細胞のストレス応答の制御に重要な役割を果たしている。また、この経路の制御異常が癌や慢性炎症性疾患に深く関与する。本研究では、ストレス応答経路の主要なヒトMAPKKKであるMTK1の活性制御機構の解明を行った。その結果、1)ストレス刺激後にGADD45分子の発現が誘導されてMTK1と結合すると、まずMTK1制御ドメインと酵素ドメイン間の抑制的な分子内相互作用が解除されてMTK1が多量体化し、さらに隣接したMTK1分子同士が相互にリン酸化し合って、強い活性化が起こることを見出した。また、2)MTK1の新たな活性化促進分子としてRACK1を同定した。さらに、低酸素によってストレス顆粒が形成されると、RACK1が顆粒内に取り込まれてMTK1-p38/JNK経路が失活し、DNA損傷による細胞死が阻害されることを見出した。即ち、ストレス顆粒形成によるMTK1の活性化阻害が、腫瘍内部低酸素環境において癌細胞が抗癌剤抵抗性を獲得する一因となっていることを示した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】18209051 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 子宮内膜症 / シグナル伝達 / proteinase-activated receptor / TGFβ / IL-6 / IL-17 / MAPキナーゼ / Th17 / IL-8 / AMPキナーゼ / メトホルミン / 着床 / 自然免疫

【研究成果の概要】

子宮内膜とその関連疾患についてのシグナル伝達機構とその制御について臨床にフィードバックできる多くの貴重なデータを得ることができ、周辺の事項も含めて発展的に理解を深めることができた。子宮内膜症に関しては、発症機序について多くの新しい知見を得ることができ、さらに、アポトーシスやT細胞免疫に新たな分子標的を見出すことにより不妊症治療につながる新たな展開をもたらした。一方、正所性子宮内膜に関しては、月経周期にともなう組織学的変化を支える種々のシグナル伝達機構や、その制御異常による不妊症などについて多くの知見を得ることができた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】49,790千円 (直接経費: 38,300千円、間接経費: 11,490千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】17570105 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

出芽酵母 / ストレス応答 / 高浸透圧 / MAPキナーゼ経路 / HOG経路 / シグナル伝達 / 酵母 / MAPキナーゼ / リン酸化 / Ssk1 / Ssk2 / Ssk22

【研究成果の概要】

環境変化に迅速に適応するため、真核生物はストレス応答MAPキナーゼ経路を備えている。出芽酵母には高浸透圧で活性化されるHOG経路が存在し、2つの独立した上流支経路(SHO1経路、SLN1経路)をもつ。本研究ではSLN1,SHO1経路活性化及び制御の分子機構を明らかにするための解析を行った。前者に関しては表題にあるSsk1が分子スイッチとして巧みにHOG経路の活性制御に関わることを解析した。後者については、SHO1経路に関わる複数の因子がアダプター機能を有し、互いにダイナミックに相互作用することで、巧妙にシグナルを伝達する仕組みを明らかにした。後者について以下に具体的に記述する。
我々はSHO1経路活性化に欠損を示すSte50のRAドメイン変異の高浸透圧感受性を抑圧するCDC42変異体の単離に成功し、Cdc42がSte50、Ste20それぞれと結合しアダプター因子として経路活性化に働く可能性を示した。またRAドメイン欠失によりSHO1経路活性化に欠損を示す変異型Ste50が膜局在配列を付加させることで経路を活性化させたことから、Cdc42との結合を介したSte50の細胞膜への移行が経路活性化に重要であることを明らかにした。以上より高浸透圧で活性化されたCdc42はSte20との結合を介しSte20を活性化すると同時にSte50との結合を介しSte50-Ste11複合体を膜にリクルートすることでSte20によるSte11のリン酸化を可能にすると考えられた。
さらに活性化したSte11はSte50とともに膜上のSho1の細胞質領域と結合し、Sho1と結合しているPbs2をリン酸化・活性化することも示し、SHO1経路において複数の因子がそのアダプター機能により精巧に各因子間の相互作用を調節し、ダイナミックなシグナル伝達を可能にしていることがわかった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】17780081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受容体 / GPCR / 遊離脂肪酸 / シグナル伝達 / GPR120 / アポトーシス / GLP-1 / MAPキナーゼ

【研究成果の概要】

遊離脂肪酸(Free Fatty Acid : FFA)は多くの組織において生理的に重要な役割を果たしている。FFA誘導体であるプロスタグランジンやロイコトリエンは細胞膜に特異的なGタンパク質共役型受容体(GPCR)を持つことから、FFA(特に長鎖)も細胞膜上に特異的な受容体を持ち、それを刺激することによって細胞内情報伝達に寄与している可能性があると考えられてきた。最近、いくつかのグループが3つのオーファン受容体GPR40,GPR41,GPR43がFFAによって活性化されることを報告した。申請者らはこれらのグループとは独立に新たな長鎖FFA受容体としてGPR120を同定し、さらに、GPR120が腸管においてインクレチンの一つであるGLP-1と分泌細胞(L細胞)において共存し、FFAによるGLP-1の分泌に関わっていることを証明した(Hirasawa et al.,Nature Medicine,2005)。本研究では、新規FFA受容体GPR120のシグナル伝達経路とその結果もたらされる生理現象の解明を目的として研究を行っている。昨年度は、マウス腸管由来STC-1細胞においてFFAによるERKの活性化が血清飢餓等によって起こされる細胞死(アポトーシス)を阻害することを下記らかにした。また、このFFAによるアポトーシス抑制作用が、GPR120を介するものであることを明らかにした(Katsuma et al.,Journal of Biological Chemistry,2005)。本年度は、他の動物種であるラットのGPR120オーソログをクローニングした(Acc#AB207868)。現在、その機能解析を行っているところである。また、昆虫等、他の生物種から脂肪酸受容体の同定を試みているが、現在のところ成功していない。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】17591115 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 細胞、組織 / MAPキナーゼ / 発生異常 / p38 / ERK / 嚢胞 / 伸展 / 細胞・組織 / 腎臓 / 胎生期尿路閉塞 / 線維化 / TGF-β / 多発性嚢胞腎 / 尿管芽細胞 / 細胞伸展

【研究成果の概要】

本研究は胎生期尿路閉塞がシグナル伝達の中核的酵素MAPキナーゼの変化を介し、異形成、低形成腎を来すという仮説をin vivoおよびin vitroの実験系を用い検証した。胎生60日で尿路閉塞術を行ったヒツジ胎仔腎は多嚢胞性異形成腎となる。嚢胞上皮において増殖、アポトーシスの亢進、線維化の指標であるTGF-βの発現増加と共にMAPキナーゼの異常(p38、活性型ERK増加、JNK減弱)がみられた。そこで尿路閉塞の流体力学的変化を尿管芽細胞周期的伸展によりin vitroで再現し、MAPキナーゼの病的意義を検討した。p38、ERKは伸展により活性化された。増殖、TGF-β発現も伸展により増加しp38、ERK阻害により抑制された。アポトーシスは増殖より遅れて増加し、p38、ERK阻害、抗TGF-β抗体により抑制された。したがってp38、ERKがTGF-β発現、増殖、アポトーシスを介し胎生期尿路閉塞による異形成腎発症に関与する可能性が考えられた。また分化した腎尿細管細胞であるIMCD細胞をJNK阻害剤存在下で培養することにより、JNKが増殖充進、アポトーシス抑制、E-cadherin発現誘導、TGF-β発現抑制を介し尿細管細胞のbranching、分化・形質維持に関与することが明らかになった。つまりJNKの発現低下も嚢胞上皮の未分化状態と関係すると考えられる。一方、胎生早期(50日)に尿路閉塞したヒツジ胎仔腎は低形成になる。胎生50日、60日閉塞腎を経時的に比較することにより、嚢胞拡大による後腎間葉細胞増殖抑制が低形成腎の原因となる可能性が示唆された。最後に、ERKの病的意義を多発性嚢胞腎のモデルpcyマウスを用い検討した。ERK阻害により腎腫大、嚢胞形成が抑制され、血圧、血清クレアチニン値は有意に低値、尿浸透圧は高値であった。以上よりERK阻害による治療の可能性が示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 300千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】17390492 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / MAPキナーゼ / ストレス / 自然免疫 / 感染症

【研究成果の概要】

我々は,恒常活性化型DASK1をショウジョウバエ個体に発現させた際,p38経路依存的にtyrosine hydroxylase(TH)の発現誘導を介してメラニン合成を亢進させることを見出した。また,DASK1によるTHの発現制御にはp38によるNR4Aファミリー転写因子のリン酸化制御が関わっていることが明らかとなり,さらに哺乳類細胞においてもこの経路が保存されていることが分かった。ショウジョウバエにおいては自然免疫応答におけるメラニン合成系の重要性が既に知られており,NR4Aファミリー分子のリン酸化制御機構が,ASK1-p38 MAPキナーゼ経路を介した自然免疫制御においても重要な役割を担うものと考えられる。また我々は,ASK1と高い相同性をもっ分子ASK2をASK1結合分子として同定した。ASK2はASK1と細胞内で複合体を形成することで,プロテアソームによる分解から免れて安定して存在し,ASK1との複合体を形成した状態で初めてMAP3Kとしてのキナーゼ活性を示し,過酸化水素などの酸化ストレスに対する反応性も示した。一方ASK2は,ASK1のキナーゼ領域内の特定のスレオニン残基をリン酸化することでASK1を活性化することも分かり,両者が互いの活性を上昇させる機構が存在することが示唆された。ASK2は,マウスの皮膚や腸管などの比較的ターンオーバーの盛んな上皮組織に多く発現している傾向があることから,粘膜免疫におけるASK1-p38経路の機能を制御する分子として重要な役割を担っているものと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】14,800千円 (直接経費: 14,800千円)

【研究分野】病態科学系歯学(含放射線系歯学)

【研究領域課題番号】13470400 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

一酸化窒素(NO) / シグナル伝達 / MAPキナーゼ / アポトーシス / stress

【研究成果の概要】

われわれは、NOによって活性化されるMAPキナーゼ系の癌化機構への関与について研究を遂行した結果、以下の2点を明らかにした。1)JNKならびにp38を制御するキナーゼであるASK1が、NOによって強く活性化されること、ASK1ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞ではNOによるp38の早期の活性化が消失していることが分かった。このことから、NOによって活性化されるMAPキナーゼ系の制御分子の1つとしてASK1が重要な役割をもつことが示唆された。2)細胞内カルシウムの増加に伴ってASK1が活性化されることを見いだした。細胞内カルシウムの増加によるNOの産生増加や、逆にNOによるカルシウムの恒常性の調節といった現象が報告されていることから、NOとカルシウムシグナル伝達系とは密接なつながりをもつと考えられている。そこでNOによるASK1-MAPキナーゼ系の活性化へのカルシウムシグナルの関与を検討するため、カルシウムによるASK1の活性化機構を検討した。細胞内カルシウムの増加によるASK1の活性化はCaMKインヒビターKN-93によって抑制されること、ASK1はカルシウム刺激依存的にCaMKIIと結合すること、さらに、活性化したCaMKIIはin vitroにおいてASK1の活性化に必須の部位のリン酸化を引き起こすことが分かった。さらに、ASK1ノックアウトマウス由来の胎児由来線維芽細胞でのカルシウムによるp38の活性化は、NO発生剤を用いた際と同じように、刺激後、早期の相だけが減弱していることが明らかとなった。以上のことからASK1がCaMKIIを介したカルシウムシグナルによるp38の活性化に必須の機能をもつことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】13,700千円 (直接経費: 13,700千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】13557150 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ストレス / シグナル伝達 / MAPキナーゼ / 生体材料

【研究成果の概要】

本研究は、炎症性サイトカインや様々な物理化学的ストレス刺激によって活性化され、細胞の生と死の制御に非常に重要なシグナルを伝達しているストレスシグナル伝達系に注目し、生体材料適合性・安全性の新たな評価系としてこの伝達系の活性化を指標とすることにより、医用生体材料の生体適合性・安全性の迅速かつ高感度な判定方法を全く新しい観点から構築することを目的とした。まず、ストレス感受性キナーゼであるJNKならびにp38の活性化を鋭敏に検出する系を確立し、さらにそれらの制御分子であるASK1が酸化ストレスによるJNK, p38の正常な活性化に必須であることを明らかにした。続いて、ASK1の活性化を鋭敏にモニターできる抗体の作製ならびにその評価を行った。我々はASK1のキナーゼ領域に存在する845番目のスレオニン残基のリン酸化がASK1の活性化に必須であることを見いだし、その部位のリン酸化状態を認識する抗体を作製した。この抗体は、これまでのin vitroキナーゼ解析によるキナーゼ活性評価法を上回る感度でASK1の活性化を認識しうることが確認された。この抗体を用いた生化学的な解析とASK1ノックアウトマウスのさらなる解析により、ASK1は酸化ストレスのみならず、小胞体ストレスによるアポトーシスの誘導にも必須の分子であることが明らかとなった。これらのことから、ASK1-MAPキナーゼ系は、予想以上の様々なストレスに対する反応性を規定する重要なシグナル伝達系であり、その活性化を捉えることが本研究の目指す生体材料評価系として非常に有用であることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】13,300千円 (直接経費: 13,300千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】10670757 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

MAPキナーゼ / ERK / p38 MAPキナーゼ / JNK / 発生 / 腎 / シグナル伝達 / 腎発生異常 / P38MAPキナーゼ / 後腎間葉細胞 / p38MAPキナーゼ / P38 / MKP-1 / 分化 / p38

【研究成果の概要】

細胞内シグナル伝達の中核的酵素MAPキナーゼ(MAPK)スーパーファミリーの腎発生における意義を検討した。まずMAPKとMAPK不活化酵素MAPK phosphatase 1(MKP-1)の腎における発現を検討した。Extracellular signal-regulated kinase (ERK)とp38MAPK(p38)、MKP-1は幼若腎に強く発現し、c-Jun N-terminal kinase (JNK)は成熟腎に発現した。活性型のERK、p38、JNKの発現もそれぞれの蛋白発現と相関した。免疫組織学的検討では、ERKはネフロン形成に伴って皮質から髄質側へ移行した。これに反し、p38は腎全体にびまん性に発現した。MKP-1の空間的発現はp38のそれと同様であった。JNKは成熟腎の尿細管すべてに発現した。
次に腎発生における機能的意義を検討した。ラット腎をERK活性化酵素MEK阻害剤PD98059、UO126、またはp38阻害剤SB203580存在下で培養、腎成長ネフロン形成、尿管芽分岐への影響を検討した。,ERKはネフロン形成と尿管芽成長に、p38は腎成長とネフロン形成に関与することが示された。
ERK、p38が腎発生において必要であることから、ERK、p38の異常により腎発生異常が生じる可能性が考えられる。そこで最も頻度の多い腎奇形、異形成腎におけるMAPキナーゼの発現を検討した。胎生10週-21歳のヒト多嚢胞性異形成腎6例につき検討、嚢胞壁におけるp38、ERKの発現増加、活性化と、JNK発現低下を認めた。同様の変化は多発性嚢胞腎モデルpcyマウス嚢胞壁にも観察された。
p38が腎成長、ネフロン形成に、ERKがネフロン形成に関与することから、腎成長、ネフロン形成に関与書,するbFGFのシグナル伝達におけるMAPキナーゼの役割を検討した。培養後腎間葉細胞においてbFGF刺激によりp38、ERKは活性化され、細胞増殖・遊走を媒介することが示された。
多嚢胞性異形成腎には尿路閉塞が高頻度に合併し、発症への関与が示唆される。そこでヒツジ胎仔尿路閉塞モデル腎におけるMAPキナーゼの発現を検討した。胎生期尿路閉塞腎の嚢胞、異形成尿細管において、細胞増殖亢進に伴いp38、ERK、P-ERKの発現増加、JNKの発現減弱が認められ、嚢胞形成に関与することが示された。
以上、正常、異常腎発生におけるMAPキナーゼの意義が明らかにされた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1998 - 2001

【配分額】2,900千円 (直接経費: 2,900千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】06680684 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

MAPキナーゼ / MAPKK / Ras / 増殖シグナル伝達 / 核移行 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

哺乳類培養細胞に恒常的活性型MAPKKとしてセリン218とセリン222をグルタミン酸の置換したMAPKKの突然変異体(SESE-MAPKK)とSESE-MAPKKのN末付近20アミノ酸を欠失させた変異体(dNSESE-MAPKK)を発現させたところ、SESE-MAPKKでは30%、dNSESE-MAPKKでは60%の内在性MAPキナーゼが活性化された。転写因子の活性を調べるために、TRE, SRE, CREのそれぞれのエレメントをCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)につないだレポータープラスミドとともに培養細胞に形質転換した。dNSESE-MAPKKはTRE-CAT発現活性を1.8倍、SRE-CATを1.7倍、CRE-CATを1.0倍上昇させた。dNSESE-MAPKKと共に野生型MAPキナーゼを共発現させると、TRE-CATは2.6倍、SRE-CATは3.1倍、CRE-CATは0.7倍になった。以上より、MAPキナーゼカスケードの活性化が、TRE及びSREの活性化に十分であり、CREの活性化には不十分であることが示唆された。
MAPキナーゼは、増殖刺激等により核移行することが知られている。我々は活性型MAPキナーゼに特異的に反応する抗体を作製し、局在を検討した。活性型MAPキナーゼはまず細胞質で活性化し、活性化よりもかなり遅れて核移行することがわかった。活性型MAPKKを発現すると、MAPキナーゼの核移行が引き起こされた。また、MAPキナーゼの中和抗体によって、MAPキナーゼの核移行が阻害された。従って、MAPキナーゼが何らかの基質をリン酸化することにより、MAPキナーゼの核移行が起こることが示唆された。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】04454105 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

乳腺 / レセプター / プロラクチン / インシュリン / MAPキナーゼ / 細胞増殖 / 成長因子 / 分化 / 乳腺上皮 / ホルモン / P34^<cdc2>キナーゼ / P32^<cdk2>キナーゼ / 分裂調節 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

インシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子は細胞培養系では乳腺上皮細胞の増殖にとって必須である。プロラクチンとプロゲステロンはこれと協同して増殖を促進する。インシュリン、IGF-I、EGFはシグナル伝達過程において、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、増殖の盛んでない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、そのいずれの時期にもMAPキナーゼが存在し、レセプターからのシグナルが伝えられると活性化される状態にある。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することは試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより特異的に増殖が刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により変化が見られず、また、酵素活性にも変化はなく、プロラクチンのシグナル伝達にはMAPキナーゼが関与していない可能性がある。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されることが知られているので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。また、乳腺は周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)