【研究領域課題番号】21K07432 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脊髄小脳変性症 / ＲＮＡ / ＲＮＡ結合蛋白 / 動物モデル / プルキンエ細胞

【研究成果の概要】

本研究では脊髄小脳失調症31型(SCA31)の病態を明らかにすることを最終目的として、代表研究者が開発したモデルマウスにおける異常遺伝子および異常タンパクを解明することである。
モデルマウスは、患者の遺伝子異常を有する染色体領域を完全に包含するBAC (bacterial artificial chromosome)をマウスに導入して作製したBAC transgenic mouseであり、高齢になると歩行障害出現するなどの神経障害がみられるモデルマウスである。このモデルマウスにおいて、初年度は歩行などの行動異常が出現する時期における複数の個体から、sacrifice後に小脳を取り出し、RNAを抽出した。併行して同年齢の野生型で遺伝的背景が同じマウスからも同様に小脳を取り出してRNAを抽出した。これらの2種類のRNAを150base-pairのpair-end法でRNA-seqを行い、初年度までにその結果を得た。そのうえで、プルキンエ細胞に特異的に発現する遺伝子に関しての遺伝子発現の変動を検索している。その結果、いくつかのRNAにおいて発現変動を認めた。
また、タンパクに関しては、当初予定したプルキンエ細胞特異的なmRNAをenrichするマウスとの掛け合わせが困難であったため、我々が有するBAC　TgマウスのRNA-seq解析から得られたデータをもとに異常RNAに対応する蛋白を検索することに方針を変換し、研究を進めることとした。
これまでの成果としては、同モデルマウスにおける歩行異常を捉えることができ、その時期を明らかにしたうえで、その時期のマウス小脳に発現するいくつかのRNAにおいて発現変動を認めた点が挙げられる。最終的には異常発現RNAを検索しつくし、定量的RT-PCR法などで異常変動を確認する。そのうえで、それらについて可能な分子についてはタンパクレベルでも検証する。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】21K06833 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核スペックル / RNA / 精神運動発達異常 / RNA結合タンパク / 転写制御 / 精神運動発達遅滞

【研究成果の概要】

NKAPタンパク機能を明らかにするために、免疫沈降質量解析を用いてNKAP結合タンパクを網羅的に同定した。NKAP結合タンパクとして多くのRNA結合タンパク、スプライス因子、RNAヘリカーゼを同定した。NKAP結合タンパクとしてSONやSRRM2といったスペックル構造因子を同定した。新規NKAP結合タンパクとしてRNA輸送に関わるTREX複合体構成因子, NXF1やXPO1を同定し、NKAPがRNA輸送制御に関わる可能性が示唆された。RNase処理を行ったサンプルでも免疫沈降質量解析を行い、これらNKAP結合タンパクはRNAを介した間接的な結合ではないことを確認している。タンパク質分解除去システムを応用したNKAP-AID細胞を用いて、NKAP除去によるNKAP結合タンパク細胞内分布への影響を調べたところ、多くのNKAP結合タンパクの細胞内分布異常を確認した。これら結果から、NKAPがNKAP結合タンパクの細胞内局在を制御することによりRNA代謝制御に関わっている可能性が示唆された。
さらにNKAP関連症候群と類似する症状を呈する新規精神運動発達異常症候群として、SRRM2遺伝子変異によるSRRM2関連症候群を同定した。臨床症状はNKAP関連症候群と同様に精神運動発達遅滞を主徴とし、筋緊張低下、注意欠陥多動性障害、成長障害等の合併を認めた。SRRM2はNKAP結合因子であり、NKAP除去によりSRRM2細胞内局在異常が引き起こされるため、NKAP変異とSRRM2変異が同様のRNA代謝異常を引き起こし、精神運動発達異常が引き起こされる可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】19K15701 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

PD-SELEX / RNAアプタマー / RNA結合タンパク質 / 進化分子工学 / 共進化 / 試験管内共進化 / 直交性ペア / RNP / L7Ae / ファージディスプレイ / SELEX / RNA / 直交性 / 分子進化 / 次世代シークエンシング / 生体直交性 / 翻訳制御

【研究成果の概要】

ライブラリー vs. ライブラリーの試験管内セレクションを行う新しい進化分子工学の手法：PD-SELEX法を開発することに成功した。1.1 x 10^12の多様性のRNAライブラリーと４．０ x 10^8の多様性のファージディスプレイL7Ae (LS)スキャフォールドライブラリーを用い、6ラウンドのセレクションを行った。次世代シーケンシングで配列の濃縮が起こっていることを確認し、RNA-RNA結合タンパク質ペアを決定するための再セレクション実験を行った。最終的に約7 pMの解離定数を示し、4000倍以上の結合選択性を示す直交性RNA-RNA結合タンパク質ペアを2つ同定することに成功した。

【研究の社会的意義】

核酸－タンパク質（ペプチド）間相互作用を解析、または結合選択性を改変するための基盤技術としてPD-SELEX法が活用できる。また、セレクションで得られた直交性RNA-RNA結合タンパク質ペア（CS1 RNA-LS4 protein & CS2 RNA-LS12 protein）は、任意のRNAとタンパク質を繋ぐアダプター分子としての利用が見込まれる。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】18H02715 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA / 小脳 / Purkinje / タンパク / TDP-43 / 脊髄小脳変性症 / ＲＮＡ / ＲＮＡ結合蛋白 / 動物モデル / 神経疾患 / 蛋白質

【研究成果の概要】

脊髄小脳失調症31型(SCA31)は、BEAN遺伝子のイントロン内にTGGAAの5塩基が1.25～2Kbに及ぶ長いリピートとして存在することを原因とする、我が国において最も頻度が高い脊髄小脳変性症の一つである。本研究では、研究者が作製したモデルマウスSCA31-BACトランスジェニック(Tg)マウスの歩行解析と遺伝子発現解析を行ったものである。詳細な定速式および加速式rotarod解析で、このマウスは生後67-68週で異常を表すことを明らかにした。同時期の遺伝子発現をRNA-seqで検証したところ、対照マウスに比べていくつもの異常を見い出した。このうち、病態の範囲を示唆する遺伝子群を抽出する。

【研究の社会的意義】

本研究は、難治性神経疾患、脊髄小脳変性症「SCA31」の病態を探索する研究である。代表研究者らは2009年にSCA31の原因を発見し、その原因遺伝子部分をマウスに導入して作製したものがSCA31 BAC-Tgである。これまでSCA31のモデルマウスは存在しないため、SCA31 BAC-Tgが、モデルマウスとして妥当かどうかを明らかにすることにもつながる。本研究の結果、このマウスでは患者と同じ遺伝子異常を発現し、67週齢頃に異常な運動症状を表していることが解った。さらに、その病態を明らかにする異常な遺伝子発現状態を確認することができ、SCA31の病態を解明する大きな進歩を果たした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】17KK0163 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA / 感染 / RNA分解 / 核内構造 / RNA結合タンパク質

【研究成果の概要】

新型コロナウイルス感染拡大のため、所属機関の要請によって海外渡航ができなくなった。また、受け入れ予定の海外研究機関にも日本からの研究者受け入れが中止になった。そのため、当初予定していたデンマークと米国の共同研究者のもとへの渡航し、現地で実験を実施ができなかった。このような事態に対応するため、実験を日本で実施し、その結果をオンラインで情報交換することによって共同研究を実施した。すなわち、実験結果を海外共同研究者とデータ解析、解釈をオンラインでおこなった。また、海外研究者に実験の一部を実施してもらい、その実験データを共有して、相互に実験データを比較する作業をオンラインでおこなった。その結果、共同研究成果として、HNRNPH1による核内長鎖ノンコーディングRNAの分解制御という新しい仕組みをRNA Biology誌に発表できた。
この研究では、核内長鎖ノンコーディングRNAとして有名なNEAT1の分解をHNRNPH1が制御していることを発見した。さらに、HNRNPH1によるNEAT1分解では、HNRNPH1とMTR4（核内RNA分解において重要な役割を担うRNA縁ケース）との物理的相互作用が重要であることを発見した。また、HNRNPH1-MTR4経路によるNEAT1分解制御の生理的意義を探った結果、NEAT1の発現制御がIL8サイトカインの遺伝子発現を制御することを発見した。この結果は、核内RNA分解の制御が自然免疫応答の制御にとって極めて重要な役割を果たすことを示すものであった。また、HNRNPH1というRNA結合タンパク質が核内RNA分解にかかわることを初めて示す結果でもあった。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化)

【研究期間】2018 - 2022

【配分額】14,430千円 (直接経費: 11,100千円、間接経費: 3,330千円)

【研究分野】環境・衛生系薬学

【研究領域課題番号】15K14987 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA / 細胞センサー / ノンコーディングRNA / RNA結合タンパク質

【研究成果の概要】

RNAの塩基配列を特異的に認識できるようにデザインしたPUM1タンパク質のRNA結合ドメインを利用し、RNA発現を検出するシステム構築を目指した。そのため、まず、細胞内の野生型PUMが制御するRNAについての情報が基盤的情報として必要であったため、RIP-seqとBRIC-seqを用いて、PUMによる分解制御を受けるヒト遺伝子群を網羅的に同定した。その結果、約50種類のRNAが野生型PUMの分解制御を受けていることを明らかにした。次に、GFPに連結した野生型PUMと変異型PUMをデザインし、現在、安定発現細胞株を樹立できた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】25291007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳制御 / microRNA / RNA結合タンパク質 / 翻訳 / RNA

【研究成果の概要】

翻訳開始段階を標的とし、翻訳を負に調節するmiRNAマシナリーの分子機構を生化学的手法で解析した。その結果、miRNAによる翻訳抑制機構がpoly(A)の短鎖化に依存しないことを2012年にPNAS誌上で発表した。次にmRNA pull-down法によりRNA-induced silencing complex(RISC)が形成されたmRNA上の翻訳因子の変化を詳細に調べた。その結果、miRNA機構がeIF4Aを標的として、翻訳開始を制御することを発見し、さらにHuDがmiRNAによる翻訳抑制を阻害することもつきとめ2014年にMolecular Cell誌上で発表した

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)

【研究分野】生命・健康・医療情報学

【研究領域課題番号】25870190 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオインフォマティクス / RNA / RNA二次構造 / アルゴリズム / RNA結合タンパク質 / 文脈自由文法 / RNA進化 / 進化 / 構造進化 / RNA構造進化 / 数理モデル / 確率文脈自由文法 / 集団遺伝学 / 合祖理論 / 二次構造

【研究成果の概要】

細胞内のRNA分子は、遺伝子に書き込まれた情報がタンパク質になり生理的な機能を発揮する上で非常に重要な役割を持つ。RNA分子の立体構造は、ステムと呼ばれる局所的二重らせん構造（二次構造）の３次元的な配置としてよく理解されることが知られており、二次構造の性質を解明することは、RNAの機能を理解する上で重要である。本研究において、我々は、メッセンジャーRNAや長鎖非コードRNAと呼ばれる長大なRNA分子に対して、その二次構造的性質を正確に計算することができるアルゴリズムの開発に世界で初めて成功した。また、RNA結合タンパク質の結合領域周辺がどのような二次構造的特徴をもつかを計算する手法も開発した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】20658065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン受容体基質(IRS) / RNAスプライシング / インスリン / インスリン様成長因子(IGF) / RNA結合タンパク質 / cross-linking immunoprecipitation (CLIP) / インスリン様成長因子 / RNA / RNA結合蛋白質 / CLIP(cross-linking and immunoprecipitation)法 / mRNA / non-coding RNA

【研究成果の概要】

申請者らは、インスリンやインスリン様成長因子(IGF)のシグナルを仲介するインスリン受容体基質(IRS)のmRNAスプライシング制御における新機能の解明を目的に研究を行った。その結果、1.293細胞やMCF7乳ガン細胞の抽出液をRNaseで処理し、IRSを含む複合体の大きさをスクロース密度分画法などで解析した結果、RNase処理によって複合体の大きさが減少したことから、これらの細胞内でIRSがRNAと複合体を形成していることがわかった。2.IRSと結合するRNAを特定するため、IRS-1を293細胞に発現し、相互作用するRNAをcross-linking immunoprecipitation(CLIP)法によって解析した結果、約40種のmRNA、スプライソソームを構成するU2snRNA、およびU6snRNAの同定に成功した。同定されたmRNAの一部はイントロン配列でIRSと結合することから、未成熟RNAとしてIRSと相互作用していると考えられた。3.IRS-1/2は細胞質に存在することが知られているが、免疫染色法による解析の結果、MCF7乳ガン細胞において一部は核内にも存在し、特にスペックル状の構造に集積していることがわかった。4.IRS-1を293細胞に過剰発現し、同定されたIRS-1結合性mRNAをPCR法で増幅した結果、一部のmRNAはIRS-1の過剰発現によって未成熟型RNAが増加したことから、IRS-1がmRNAスプライシングを抑制すると考えられた。一連の解析から、核内における未成熟mRNAのスプライシング制御というIRSの新機能を示すことに成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】分子遺伝学・分子生理学

【研究領域課題番号】03404072 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分裂酵母 / cAMP / A-キナーゼ / 減数分裂 / RNA / RNA結合タンパク質 / 有性生殖 / 接合 / 接合フェロモン / フェロモン受容体 / 情報伝達 / 栄養源 / 性的分化 / アデニル酸シクラーゼ / Gタンパク質 / 接合フェロモン受容体 / 転写因子 / HMG / DNA結合タンパク質

【研究成果の概要】

分裂酵母は炭素源や窒素源の状態を感知・判別し、新たな細胞分裂周期を開始するか、接合・減数分裂への性的分化を開始するかを決定する。接合の際には、接合フェロモンを受容することで相手型細胞の存在を認識する。このような性的分化開始の決定に至る一連の分子機構を解明することは、細胞の環境認識、細胞周期の制御、あるいは細胞機能分化など、細胞生物学の基本問題の理解に大きな貢献をもたらすと考えられる。本研究により当該年度に得られた新知見は以下の通りである。1.分裂酵母の有性生殖開始に必要な遺伝子群が窒素源飢餓により転写誘導されること、さの際にcAMPが栄養状態を反映し、情報伝達を仲介することを、cAMP依存性タンパク質リン酸化酵素(A-キナーゼ)の触媒サブユニットの遺伝子を単離してより確実なものとした。2.減数分裂開始に関わる重要な因子であるmei2遺伝子産物がRNA結合タンパク質であることを証明し、Mei2タンパク質の機能が、従来から知られている減数分裂前DNA合成開始のみならず、減数第一分裂にも必須であることを示した。さらに、減数第一分裂を推し進める際にMei2タンパク質と複合体を作って機能する、長さが約0.5-kbでPoly(A)tailをもつmeiRNAを同定した。meiRNAは減数分裂に特異的に必要とされることが明瞭に証明された初めてのRNA分子種である。3.分裂酵母の様々な有性生殖関連突然変異株につき、その欠損を相補することができる遺伝子を高等植物のシロイヌナズナから数多く単離し、酵母を宿主とする機能相補の手法が、高等生物からの遺伝子クローニングの有力な戦略であるということを示した。ただし、得られた遺伝子が植物体で有性生殖過程に関わっているか否かの証明は今後の課題である。同様な手法で、高等動物から有性生殖関連の遺伝子をクローニングする試みも推進した。

【研究種目】一般研究(A)

【研究期間】1991 - 1994

【配分額】26,900千円 (直接経費: 26,900千円)