【研究領域課題番号】19K07971 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

mGluR5 / 代謝型グルタミン酸受容体 / 小脳 / mGluR1 / シナプス形成 / 瞬目反射条件付け学習 / GRM5 / トランスジェニックマウス / レスキュー / 神経変性 / シグナル伝達 / cerebellum / transgenic / mouse / L7 / neurodegeneration / 遺伝子操作マウス / 神経疾患 / グルタミン酸受容体

【研究成果の概要】

代謝型グルタミン酸受容体mGluRはGタンパク質共役型受容体であり、グループIに属するmGluR1とmGluR5はGqを介してシグナル伝達を行う。mGluR1は主に成体マウスの海馬歯状回、視床、小脳皮質で、mGluR5は大脳皮質、線状体、海馬CA1-CA3領域で多く発現しており、相互排他的な発現をしている。小脳ではmGluR5 の発現量が発達期から成熟期へ向けて減少し、それとは対照的にmGluR1の発現量は発達期から成熟期へ向けて増加していく。脊髄小脳変性症のモデルマウスでは、成体の小脳プルキンエ細胞において、mGluR1の発現量が減少するとともに、mGluR5の発現量が増加していることが報告されており、mGluR1やmGluR5が様々な精神疾患や神経変性疾患と関連していることも数多く報告されている。しかしながら、これら2つのmGluRの機能的差異と疾患との関係については明らかとなっていない。
本研究では、小脳プルキンエ細胞特異的にmGluR5を発現するようなマウスを作製し、このマウスをmGluR1ノックアウトマウス(mGluR1 KO)と掛け合わせた。mGluR1 KOマウスでは、シナプス形成の異常、小脳運動失調、瞬目反射条件付け学習の異常などが見られるが、mGluR5トランスジーンによりこれらの表現型すべてが回復することがわかり、小脳プルキンエ細胞ではmGluR5がmGluR1の機能を代替できることがわかった。しかしながら、mGluR5をmGluR1のかわりに発現するマウスでは、mGluRの足場タンパク質であるHomerとの結合量が少ないことが観察され、シグナル伝達効率に違いがあることが示唆された。また、これらのマウスでは加齢と共に体重減少も観察されるため、神経変性疾患で共通して見られる神経機能障害などの病態・病因の解明につながると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】神経生理学・神経科学一般

【研究領域課題番号】15K06701 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

mTOR / トランスジェニックマウス / 小脳 / 遺伝子操作マウス / 小脳プルキンエ細胞 / マウス

【研究成果の概要】

小脳プルキンエ細胞におけるmTORシグナルの役割を明らかにするために、プルキンエ細胞特異的に活性化型mTORを発現するトランスジェニックマウスの作製・解析を行った。このマウスでは、プルキンエ細胞の細胞体および樹状突起が顕著に肥大化しており、離乳期を過ぎるとプルキンエ細胞のアポトーシスによる細胞死が観察された。プルキンエ細胞の変性に伴い、このマウスは運動失調を呈するようになったが、自閉症様の社会行動異常は観察されなかった。これらの結果より、小脳プルキンエ細胞においてmTORシグナルは細胞の生存およびサイズを制御していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】23390093 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

疾患モデル動物 / アミロイドーシス / 伝播 / 線維形成 / Apolipoprotein A-II / 治療 / マウス / SAA / ApoA-II / トランスジェニックマウス / 小胞体ストレス / アミロイド / コレステロール / ApoA-I

【研究成果の概要】

アミロイドーシスは蛋白質が病的構造を取り、アミロイド線維として組織に沈着し障害を与える疾患群であり、患者数も多く病態の解明と治療法の開発が希求されている。マウスAApoAIIアミロイドーシス等のモデル動物を用いて、①プリオン病と類似した糞や血液を介した『アミロイド線維の伝播』が、アミロイドーシス発症や病態の進展に重要な要因である。②アミロイドーシス発症はApoA-I や小胞体ストレス応答反応等の蛋白質恒常性維持機構が関与する。ことを明らかにした。これらの結果に基づき、線維形成抑制ペプチドや恒常性維持機構調節を介したアミロイドーシスの治療、予防法の開発を目指している。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2011-04-01 - 2014-03-31

【配分額】19,760千円 (直接経費: 15,200千円、間接経費: 4,560千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】18591167 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

steroidogenic acute regulatory protein / ステロイドホルモン / 細菌人工染色体 / 緑色蛍光蛋白質 / トランスジェニックマウス / マウス

【研究成果の概要】

本研究はsteroidogenic acute regulatory protein(StAR)のステロイドホルモン生合成におけるコレステロール転送機構を解明することを最終的な目標とし,in vivoにおけるStAR構造機能解析系の確立を目指すものである.当助成期間においては,マウスStar遺伝子のin vivoでの発現に十分なcisエレメントを決定することを目的とし,Star遺伝子本体と5'非翻訳領域47kb,3'非翻訳領域62kbを含む細菌人工染色体(BAC)をrecombinase A発現大腸菌内で相同組み換えにより修飾し,Star遺伝子の内因性転写調節領域により誘導される緑色蛍光蛋白質(eGFP)レポター遺伝子トランスジェニックマウス(Star/eGFPトランスジェニックマウス)を作成した.Star/eGFPトランスジェニックマウスにおけるeGFP発現を細胞別・発達段階別に解析した結果,日齢0および月齢2の副腎と性腺におけるeGFPと内因性StARの発現分布が一致することを蛍光顕微鏡,免疫組織化学染色により確認し,月齢2の副腎と精巣のeGFP mRNA量と内因性StARの発現量が同程度であることをreal time RT-PCRにより確認した.以上より,Star遺伝子本体と5'非翻訳領域47kb,3'非翻訳領域62kbを含む計114kbのStar遺伝子転写調節領域が副腎と性腺におけるin vivoでのStarの発現誘導に十分なcisエレメントを含むこと,Star/eGFPトランスジェニックマウスがStar遺伝子発現解析のために有用なin vivo系統マーカーを提供することが証明された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,940千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 540千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】17390140 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自己免疫 / サイトカイン / 関節リウマチ / 疾患モデル動物 / 樹状細胞 / 炎症性疾患 / 自然免疫 / C型レクチン / マウス / 発生工学 / 自己免疫疾患 / マイクロアレイ / ノックアウトマウス / トランスジェニックマウス

【研究成果の概要】

我々はHTLV-I TgマウスとIL-1Ra KOマウスの2種類の関節リウマチモデルを独自に開発し、その発症構の解析を行って来た。マイクロアレイによる発症関連遺伝子の網羅的解析の結果、樹状細胞やマクロファージで発現するC型レクチンファミリーに属する遺伝子が2種類のモデルマウスの関節局所で発現亢進していることを見いだした。本研究ではそれらのC型レクチンのノックアウト(KO)マウスを作製し、これらの遺伝子の、1.樹状細胞の分化・増殖における役割、2.抗原提示能におよぼす影響、3.関節炎発症における役割、を明らかにすることを目的とした。
現在までにこのC型レクチンファミリーに属する遺伝子のうち、3種類のKOマウスを作製した。そのうち、Dectin-1はβグルカンのレセプターであり、サイトカイン産生と活性酸素種(ROS)を同時に産生することを明らかにした。また、病原性真菌であるP.cariniiの感染防御に重要な役割を果たしていることを示した。また、DCIRは細胞内に抑制性モチーフであるITIMを有するが、機能は不明であった。このDCIR KOマウスを作製したところ、自己免疫性の唾液腺炎や関節炎を自然発症する事を見いだした。In vitroでは、骨髄由来樹状細胞(BMDC)が野生型マウスに比較しより増殖していた。この時、GMCSF受容体の下流のシグナルを伝えるSTAT5のリン酸化が亢進していた。さらにDCIR KOマウスはコラーゲン誘導関節炎に対する感受性も亢進しており、発症率が高くなっていた。このことから、DCIRは関節炎治療薬の標的となる可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】15,550千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】16591248 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

組織適合性抗原 / 調節性T細胞 / CD4陽性CD25陽性 / ペプチド / トランスジェニックマウス / 胸腺 / 移植 / 免疫寛容 / HLA / CD4+CD25+T細胞 / マウス / 心移植 / 移植免疫 / CD4CD25 / 制御性T cell / FoxP3

【研究成果の概要】

ドナー由来の抗原をレシピェントに投与して免疫寛容を誘導する方法は、動物実験では成功しているが、臨床的に確立するまでに至っていない。我々はこれまで、2種類のHLAトランスジェニックマウスを用いた心移植実験で、ドナーのHLA-B35分子由来ペプチドを胸線内に投与することにより、免疫寛容を誘導することに成功している。
一方、自己免疫疾患におけるCD4+CD25+T細胞(regulatory T細胞)の重要性が知られている。CD4+CD25+T細胞に特異的に発現している遺伝子でFoxp3という転写因子があり、この遺伝子をCD4+CD25-T細胞に導入すると抑制作用を示すことが知られている。また、Foxp3はCD4+CD25+T細胞以外の細胞では機能していないため、regulatoryT細胞のよいマーカーとなる。
前記の免疫寛容の機序を解明する目的でCD4+CD25+T細胞に着目した結果、次のことが判明した。すなわち、ドナーのHLA-B35分子由来ペプチドを胸線内に投与後4週間経過したマウスの脾細胞を採取し、CD4+CD25+T細胞を分離生成して、無処置のレシピェントに移入すると、その2週間後移植した心臓は永久生着することが判明した。さらに、third partyのドナー心は生着延長効果がなかった。つまり、ドナーのHLA分子由来ペプチドを胸線内に投与するだけで、ドナー特異的CD4+CD25+T細胞が末梢に出現し、これを移入することで、免疫寛容が誘導できるのである。
さらに、移植心の浸潤細胞におけるFoxp3の発現を検討すると、寛容が誘導された心臓にはFoxp3が高発現していることがわかった。一方、脾細胞中のFoxp3の発現は、コントロール群と差がなかった。すなわち、ペプチド胸腺内投与により誘導されたCD4+CD25+T細胞が移植心に集積して、免疫寛容誘導を引き起こしている可能性が高い。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】基礎獣医学・基礎畜産学

【研究領域課題番号】14360174 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Cre / Pseudo loxP / loxP / トランスジェニックマウス / DNA顕微注入 / 遺伝子導入 / トランスジェニック / マウス / loxp / Cre酵素 / Pseudoloxp / psedoloxp / CAG

【研究成果の概要】

生殖系列に遺伝子を導入する際に利用されるDNA顕微注入法は、DNAの注入が前核でのDNA複製の開始が後に行われた場合、生産されたTg個体にはしばしばモザイクとなる。もし、外来遺伝子を保有する細胞が生殖細胞に分化していないと、外来遺伝子は子孫へ伝達されないためTg動物は一代限りのモザイクTg動物となる。DNA顕微注入法を利用してモザイクTg動物が作出されないように外来遺伝子を宿主ゲノムのpseduolox部位に組み込ませるためには、前核期胚でDNA複製前に注入したCre遺伝子の発現があり、この酵素の作用により外来pseudoloxp部位をもつ遺伝子と宿主ゲノム内のpsedoloxp部位との間で組み換えが起こることである。そこで、1)前核に注入したCre発現ベクターと両側にpseudoloxp部位をもつLaxZプラスミドを前核に注入したところ、DNAの複製前にCre酵素の発現とpseudoloxp部位での組み換えが生じたことが確認された。2)前核期に注入したCre酵素が発現し、宿主ゲノム内に存在するpseddoxp部位を認識して組み換えを起こすかを検証した。CMV/loxP/CAT/loxP/LacZ遺伝子が導入されたTgマウス(大阪大学医学部宮崎純一教授より供与)を通常のマウスと交配して採取した受精卵にDNA顕微注入法によりCAG/Cre発現ベクターを注入し、体外で桑実胚あるいは胚盤胞まで発生させた結果、DNA複製前で組み換えに組み換えが起ることが判明し、さらに、内在loxp部位で高い頻度で組み換えの起ることを見い出した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】14380383 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

グリーンマウス / グリーンラット / レッドマウス / 着床 / キメラ / MAPC細胞 / 異種胚キメラ / ジフテリアトキシン / Creリコンビナーゼ / トランスジェニックマウス / loxP / 骨髄細胞 / 幹細胞 / GFP / 異種移植 / ラット / マウス / 妊娠

【研究成果の概要】

異種胚生着の目標の一つは、臓器移植などに使用できるような臓器を異種の動物に作らせることである。そのために必要なことは、目的の臓器を欠損した動物と、その臓器以外が欠損するような動物を組み合わせることにある。異種キメラにおいて片方の胚に由来を限定する方法について検討を行った。
即ち、ジフテリアトキシンをLoxP配列で挟んでおき、Creリコンビナーゼが働いたときにだけ毒素遺伝子が転写されるようにしくんだトランスジーンを作製した。ついでこのトランスジーンをもつトランスジェニックマウスを作製し、現在ひとつのラインを樹立した。さらにこのラインのほかに臓器特異的に発現するCreリコンビナーゼとして、精子が産生されるときにのみ働くプロタミンのプロモーターを用い、その制御下にCreリコンビナーゼを発現するようにしたトランスジーンをもつ別のトランスジェニックマウスを作製した。このように作製したジフテリアトキシンをもつトランスジェニックマウスと、Creリコンビナーゼをもつマウスを交配して、得られる産子に初期の目的どおりのフェノタイプが現れるか否かを検討したところ、計画通りに精子を欠損する不妊のマウスが得られた。このことからわれわれの設計どおりに、一部の臓器のみを欠損させる動物をデザインどおりに作製できることが示された。
またキメラマウス作製の過程で雌雄キメラを作製し、一個体内における雌雄細胞の分布やその運命について検討を加え、雄に分化した個体の中では雌の細胞も精原細胞になることを見出すとともに一部雌細胞は精巣の中で卵子に分化できることを示し生殖細胞の性の分化に関する基本的な仕組みを明らかにするとともに、異種キメラによる生殖細胞の作出のための基礎データをえることができた。
これらの研究を通じて異種キメラ作製法を基本にした臓器移植の基礎データをかためることができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】16,000千円 (直接経費: 16,000千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】13557141 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マウス / 子宮内膜 / 着床 / calcium bindidng protein D-9K / Cre-loxP / トランスジェニックマウス / calcium binding protein D-9K / 子宮 / 妊娠 / 脱落膜

【研究成果の概要】

本研究では、着床に関わる子宮機能を標的にした妊孕能制御システムの開発を目的として、以下の戦略により妊孕能の制御可能なマウスモデルの作成を試み、以下の点を明らかにした。
[1]子宮腔へのcalcium bindidng protein D-9K (Cabp9K)遺伝子およびantisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN)導入システムの確立のための検討
着床期特異的発現パターンを示すことが報告されているCabp9Kを解析対象遺伝子として、その遺伝子導入のための条件設定を行うと同時に、Cabp9K発現ベクターおよび蛍光標識AS-ODNの作成とそれらの機能検定を行い、マウス線維芽細胞株を用いた遺伝子導入システムにおいて、それらが機能しうることを確認した。一方、LacZあるいはGFP発現ベクターなどをレポーターとして、HVJ-envelopeや様々なliposome系の導入試薬を用いて、子宮への導入遺伝子の浸透度・分布度の解析を行った。既報に比べて低い導入効率しか得られず、既報の方法の再検証の必要性を示唆する新しい知見と、今後のシステム開発のための有用な基盤情報が得られた。
[2]Cre-loxPシステムを用いた妊孕能制御可能マウスモデルの作成とその検定
子宮内膜上皮特異的に発現すると考えられている遺伝子のプロモーターを組み込んだトランスジェニックコンストラクトを作製し、常法に従いマウス受精卵前核にマイクロインジェクションして複数系統のCre発現トランスジェニックマウスを得た。In vitroおよびin vivoにおいて子宮特異的にCreを誘導し得ることが、RT-PCRおよび免疫組織染色により明らかとなった。現在、ROSA26などのブルーマウスとの交配によって得られたF1マウスにおいて、時空間特異的にCre-loxPシステムが機能するか否かを検討中である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】14,200千円 (直接経費: 14,200千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12671142 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

HLA / ペプチド / 遺伝子導入 / 樹状細胞 / DC / マウス / 移植 / 免疫寛容 / 免疫制御 / トランスジェニックマウス / 異所性心移植モデル / HLAクラスI抗原

【研究成果の概要】

研究課題:HLA分子由来ペプチドと遺伝子導入樹状細胞を用いた寛容誘導の研究。
研究計画要旨及び実績概要:我々は以前、HLA抗原(HLA-B35及びHLA-B51)を移入したTransgenic mouse(TGM)2種類を作成し,HLAクラス1分子の免疫応答における役割を直接in vivo(異所性心移植モデル)で解析するシステムを開発した。このモデルにてドナー由来の合成ペプチドのレシピエント胸腺s内投与により移植心の生着延長を認めている(60日以上)。今回我々は、成人の退化した胸腺に変わり得るものとして、強力な抗原提示能を有する樹状細胞(DC)に着目し、遺伝子レベルで操作したDCと、上記アロ由来ペプチドとの接触により、胸腺内投与と同様の末梢性免疫寛容を上記TGM移植モデルにて誘導するのを目的としている。HLA抗原を移入したTGM2系統(C3H. B35及びC3H. B51)の回復及び免疫応答の確認:凍結胚からの回復後、約半年間の交配過程を経てTGM2系統共にホモ接合性の繁殖可能な個体が得られた。当研究計画の要ともいえる2系統間の同種免疫応答をin vivo及びin vitroにて確認した。C3H. B35からC3H. B51への皮膚移植片は平均15日間で90%が拒絶され、異所性心移植片は平均24日間で拒絶された。これらは当研究計画の基礎となる安藤らの報告(Ando and Beck et al.,Transplantation 68,904-908,1999.)とほぼ合致する所見である。また、C3H. B35皮膚移植片にて感作されたC3H. B51脾細胞を応答細胞、ガンマ線照射処理C3H. B35脾細胞を刺激細胞とし、混合培養することにより、E:T比80:1で50%を超える%特異的細胞障害活性を持つ同種(この場合はC3H. B35に対する)特異的細胞障害性Tリンパ球を生成し得た。マウス樹状細胞(DC):骨髄由来細胞から付着細胞を除外しGM-CSFおよびIL4を作用させることにより、混合白血球反応にて確認しうる同種免疫応答を惹起するアロ樹上細胞を生成し得た。これらのDCを使用してTGMの心移植、皮膚移植を行い、寛容誘導が可能か否か検討する。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】08557047 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Csx / GATA-4 / ANP / トランスジェニックマウス / Zf11 / ホメオボックス / マウス / 心臓 / two-hybrid system / CSX / 心筋 / 発生 / COS-7細胞 / 転写

【研究成果の概要】

1. CSXとGATA-4によるANP遺伝子の転写調節 ヒトCSXcDNAおよびマウスGATA-4cDNAを発現ベクターに組み込みANP遺伝子のプロモーター領域を含むレポーター遺伝子とともにCOS-7細胞に導入しtrans-activation活性を解析した。CSXによるANP遺伝子の転写亢進には、転写開始点上流-100bpおよび-250bpに存在するCSX結合配列が重要であり、CSXとGATA-4を同時に発現させると、ANP遺伝子の転写は相乗的に亢進し、その協調作用には-250bpに存在するCSX結合配列が必要であった。さらに、CSXとGATA-4はin vivoおよびin vitroにおいて蛋白同士が直接会合した。以上より、心筋に発生早期より発現し異なるDNA binding motifを持つ転写因子であるCSXとGATA-4が、直接的な蛋白-蛋白相互作用を介してANP遺伝子の転写を協調的に制御することが明らかにされた。
2. CSX1過剰発現マウスの解析 CSX1過剰発現マウス(Tg)を作製し解析した。Tgは生存及び生殖可能であり、外奇形や成長障害、心不全症状を認めず、心重量の増加も認めなかった。Tgにおいて心臓と骨格筋にCSX1 mRNAの過剰発現が認められた。内因性Csxの発現はCSX1 の過剰発現により有意に増加を認めた。以上より、TgにおけるANPの誘導はCSX1の直接の作用である可能性が考えられた。また、内因性Csxの発現が増加していたことからCsxの発現調節に正の自己調節機構があることが示唆された。
3. Csx/Nkx2.5と会合する新たな転写因子Zf11の発見と解析 ヒトCSX遺伝子cDNA全長を用いtwo-hybrid systemにてマウス胎生17日のcDNA libraryをスクリーニングした。20個のうち1個はC2H2型のzinc fingerを11個と核移行シグナルを持つ転写因子と考えられ、Zf11と名づけた。two-hybrid systemではCsxのN-末端とhomeo domainが会合に必要と考えられ、pull down assayではZf11のzinc finger domainが会合に重要であった。マウスのES細胞において、分化前および分化誘導後3日では発現がなく、6日目以降より発現が認められた。8日目よりミオシン等の収縮蛋白の発現が認められ、自発収縮が始まることより、Zf11はこれらの心筋特異的な収縮蛋白などの発現に関与していると考えられた。Whole mount in situ hybridizationにおいて、Zf11は心臓の形成されるマウス胎仔8日目頃より心臓の原基において発現していた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】17,000千円 (直接経費: 17,000千円)