【研究領域課題番号】22K10014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エクソソーム / 薬剤性顎骨壊死 / 間葉系幹細胞 / 再生医療

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2022-04-01 - 2025-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究領域課題番号】21K16908 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

間葉系幹細胞 / 眼表面難治疾患 / 再生医療 / 幹細胞移植療法

【研究成果の概要】

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(以下、ADSC)は、骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞への分化能を有し、免疫調節機能・抗炎症作用を有することから既存治療に抵抗性を示す免疫疾患等に対する新たなモダリティとして期待されている。本研究では免疫学的異常を機序とする眼表面難治疾患モデルとして慢性移植片対宿主病(cGVHD)モデルを用いADSCの有効性評価について検討を行った。有効性評価モデルとして慢性GVHDモデルが作成された。ADSC移植後3週間で角膜上皮障害（フルオレセインスコア）において、ADSC移植群は陰性対照群と比して有意な上皮障害改善効果を認めた。また眼混濁スコアも移植群の透明治癒率において有効性を呈した。体内動態を評価する為に、レンチウイルスベクターによりルシフェラーゼ遺伝子を導入したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（以下、ffLuc-ADSC）を単回結膜下投与し体内分布を評価した。ffLuc-ADSCの体内分布は、in vivo発光イメージングによる発光シグナルの検出、及びヒト特異的Alu配列のリアルタイムPCRによる試料中のヒト由来DNAの検出により評価した。本評価法では、ffLuc-ADSCは投与後、眼球、眼球組織に分布するが、7日以内に消失することが明らかとなった。以上より、ADSCの眼結膜下投与は重症眼表面ドライアイモデルにおいて眼表面障害に対して有効性を認め、新たな眼表面疾患への新たな治療の可能性として期待できうることが実証された。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2021-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究領域課題番号】20K06388 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬角膜上皮細胞 / 肝細胞成長因子 / 角膜再生医療 / 角膜上皮シート / 間葉系幹細胞 / 犬 / 角膜損傷 / 肝細胞成長因子（HGF） / 再生医療

【研究成果の概要】

今年度は、犬角膜上皮細胞に対する肝細胞成長因子（HGF）の作用を検討するため、犬角膜上皮細胞におけるHGF受容体であるc-Metの発現解析とHGFによる作用の解析を行った。犬角膜上皮細胞のｃ-Met発現を免疫染色にて解析したところ、比較的肥大した細胞においてｃ-Metの発現を認めた。小型で増殖している細胞においてはc-Metの発現は低い傾向にあり、c-Metは比較的分化・成熟が進んだ角膜上皮細胞に発現すると考えられた。
次に、c-Metのリン酸化について検討するため、犬角膜上皮細胞を50ng/mLのリコンビナントヒトHGFで刺激をおこなったところ、c-Metのリン酸化は添加後15-30分で亢進した。次に、犬角膜上皮細胞に対するHGFの作用を検討するため、培地に0-100ng/mLのリコンビナントHGFを添加して増殖能に対する影響を検討したが、HGFの添加により細胞増殖能への影響はみられなかった。次に、Migration Assayを行ったところ、50-100ng/mLの濃度で細胞の運動能が有意に上昇することが明らかとなり、HGFは犬角膜上皮細胞の運動能の上昇に寄与することが明らかとなった。したがって、犬角膜損傷において、HGFは角膜上皮細胞の増殖促進には寄与しないが、運動能を上昇させることにより損傷部の上皮化速度が上昇することが期待できた。
また、研究計画を一部変更し、角膜上皮以外に角膜内皮についても研究に取り込むことを目的として、犬角膜内皮細胞の培養に取り組み、犬角膜内皮細胞の培養条件を検討した。培養法の確立には至っていないが、犬角膜内皮細胞の培養が可能であることを確認できている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】20K09087 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医療 / 間葉系幹細胞 / 虚血再灌流 / 肝移植 / 肝虚血再灌流血流障害 / ASCL

【研究成果の概要】

ラット肝虚血再灌流モデル（70%虚血）において、虚血開始24時間前にコントロール（生理食塩水）、ASC、ASCLをそれぞれ脾臓注入したモデルを作成した。120分虚血後の生存率は、無治療のコントロール群と比べ、ASCL又はASCの前投与群では生存率が有意に上昇していた。60分虚血後のAST/ALT値は、再灌流3時間後ではASCL群はコントロール群と比較し有意に低下し、24時間後も同様に低値であった。HE及びTUNEL染色ではコントロール群と比較し、ASCL及びASCs群ではアポトーシスと組織障害が明らかに軽減した。肝組織障害をSuzuki scoreで定量化：コントロール群に比し、ASC及びASCL群では有意にスコアが低下した。肝臓組織のPCR検査値においいてASCL群では、TGF-β,IL-10, IL-1Raの遺伝子発現量が有意に上昇し、IL-6の遺伝子発現量は有意に減少を示した。血清のELISA測定において ASCL群ではTGF-β,IL-10の濃度が上昇し、IL-18の血清濃度はコントロール群より有意に減少を示した。肝臓組織のタンパク発現(Western blot法)においてASCL群では、NLRP3, cleaved Caspase-1, IL-1β, IL-18の蛋白量発現量が低下した。以上より、ASCLはin vivoにおいても抗炎症性サイトカインを発現することにより、虚血再灌流障害を抑制する可能性が示唆された。今後はラット肝移植モデルを作成し、同様の実験を行う予定である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究領域課題番号】19H03124 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬 / 脊髄損傷 / 再生医療 / メカニカルストレス / 骨髄脂肪細胞周囲細胞 / 血管新生因子 / 間葉系幹細胞 / トレッドミルトレーニング / 脊髄再生医療 / リハビリテーション

【研究成果の概要】

犬の骨髄脂肪細胞周囲細胞（BM-PACs)にシアストレスが加わることで、血管内皮増殖因子（VEGF）の発現上昇が起こることを明らかにし、BM-PACsを用いた脊髄再生医療において、運動療法は移植されたBM-PACsにシアストレスを与え、血管新生作用を強化することで組織再生や機能改善の促進が期待された。実際に脊髄損傷による歩行困難を呈した犬に対し、BM-PACsの経静脈投与とリハビリテーションを組み合わせた治療の臨床試験を行ったところ、1例のみであったが、BM-PACs投与後、後肢随意運動の回復がみられ、さらにリハビリテーションを介入させることで、歩行可能なレベルへの改善がみられた。

【研究の社会的意義】

近年、自発的な回復が期待できない脊髄損傷に対し、さまざまな幹細胞を用いた再生医療の開発が医療および獣医療で進めらており、実際に臨床応用も行われるようになっている。本研究は、そのような再生医療が発展し、適応されるようになってもなお、リハビリテーションが重要な治療法でありうることを示し、また、再生医療によりもたらされる治療効果を相加的に向上させうる可能性を示すものである。メカニズムについては十分な検討には至らなかったが、再生医療において細胞の機能性を高める因子として、リハビリテーション（運動療法）により発生しうるメカニカルストレスという新たな概念を提唱しうるものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究領域課題番号】19H03123 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬 / 間葉系幹細胞 / 脊髄損傷 / 再生医療 / 骨髄脂肪細胞周囲細胞（BM-PAC) / 病期分類

【研究成果の概要】

急性期脊髄損傷を対象とした実験では、他家移植による治療効果を検討した。免疫不全マウス脊髄損傷モデルに犬BM-PACを投与した場合と比較し、正常な免疫を持つマウスに犬BM-PACを移植した場合は、治療効果が低減した。また、ビーグル皮下に他家BM-PACを移植したところ、T細胞やマクロファージの浸潤がみられた一方で、自己細胞の場合は、それらの細胞の浸潤はみられなかった。これらのことから、間葉系幹細胞であるBM-PACはホストからの免疫を受けており、他家移植は自家移植と比較し、移植効果を得ることが難しいと考えられた。他家移植は急性期症例に対する迅速な治療法として期待できるが、免疫抑制剤などとの併用が必要であることが示唆された。
一方、慢性期脊髄損傷を対象とする実験では、これまで、BM-PACから神経細胞様の形態と遺伝子発現特性を有する細胞の誘導に成功しており、本年度はさらに、誘導後の細胞が神経組織を構築する能力を有するかどうかを検証するため、ニューロスフェアへの誘導を行い、３次元培養により構築された組織の神経組織としての性状を評価した。その結果、平面培養と比較して、３次元培養を行なった場合は、未分化マーカーであるSOX2やOCT4の発現上昇がみられ、近年、ヒト神経幹細胞マーカーとして提唱されているMusashi1の発現上昇も確認され、3次元培養ではより未分化な神経幹細胞様細胞がニューロスフェア内に誘導されると考えられた。ニューロスフェアは培養を継続すると成熟神経細胞マーカーの発現もみられるようになり、BM-PACから神経幹細胞様細胞を含むニューロスフェアを形成可能と考えられた。また、一部のスフェアにはTyrosine HydroxylaseやChATの発現が上昇しており、誘導されたニューロスフェアから、特定の機能を有するニューロンへ分化誘導が可能であることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】16,640千円 (直接経費: 12,800千円、間接経費: 3,840千円)

【研究領域課題番号】19K10182 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞治療 / 薬剤関連顎骨壊死 / 間葉系幹細胞 / 再生医療 / 薬剤性顎骨壊死 / 骨粗鬆症 / 顎骨壊死 / 免疫 / ビスフォスフォネート

【研究成果の概要】

薬剤関連顎骨壊死は骨粗鬆症の治療薬などの投与で発生する疾患であり治療法はまだ確立されていない。間葉系幹細胞による細胞治療は、間葉系幹細胞が骨を作る細胞の供給源となるだけでなく、骨細胞の活性促進因子を供給するため、有効な治療法と期待されている。しかし間葉系幹細胞は免疫抑制作用を有するため、感染が進行した難治性の患者を治療する目的で投与することはリスクが高い。一方、間葉系幹細胞の免疫調整機機能には不明な点が多く、免疫を活性化することを示した報告もある。そこで本研究では免疫活性化作用をもつ間葉系幹細胞の亜集団を検索し、難治性薬剤性顎骨壊死に対する治療効果を検討した。

【研究の社会的意義】

間葉系幹細胞による顎骨壊死に対する細胞治療の研究は、殆どが発症初期のモデルを用いて評価している。しかし臨床に展開していく上では難治性のモデルを用いた評価をおこなうことが重要である。本研究の特色は、間葉系幹細胞の免疫制御作用に着目し、これまで免疫抑制作用がクローズアップされてきた間葉系幹細胞による細胞治療を感染の進行により憎悪するリスクのある疾患に対し、安全かつ確実に適応させるための方策を新たに作出する点にある。得られた知見は細胞治療の分野において有意義なものとなる可能性がある。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】18H02985 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES細胞 / 間葉系幹細胞 / 歯根膜由来間葉系幹細胞 / 細胞治療 / 歯周組織再生 / 神経堤細胞 / 分化制御 / 歯周病 / 歯根膜細胞 / 分化誘導 / iPS細胞 / 再生医療 / 細胞分化 / ES/iPS細胞 / 細胞ソース / ヒトES細胞

【研究成果の概要】

本研究では、多能性幹細胞であるヒトES細胞から神経堤細胞に効率よく分化技術開発、さらには神経堤細胞から間葉系幹細胞に効率よく分化させる技術開発を実施した。神経堤細胞への分化誘導はある程度確立されているものの、更なる高効率を目指すために、各種細胞外マトリックスを用いた。とある細胞外マトリックスを用いることで、従来に比べて高効率に神経堤細胞を誘導できる培養条件を決定した。また、神経堤細胞から間葉系幹細胞への分化は従来法を用いて実施した。本細胞とすでに私共で保持しているPDL-MSC細胞株のトランスクリープトーム解析の結果を比較検討することで歯周組織再生に適した細胞の遺伝子プロファイルの指標を得た。

【研究の社会的意義】

歯周病は、本邦において歯を失う最大の原因である。我々は、歯科領域で日常的に抜歯されている親知らずなどの不働歯から歯根膜由来間葉系幹細胞(PDL-MSC)を単離し、重度歯周病患者の治療に応用することで、その安全性と有効性を示してきた。本研究では、無限の増殖能を持つヒトES細胞に着目し、ES細胞から最終分化産物であるPDL-MSCを分化誘導するための手法とその過程を詳細に検討することにより、ES細胞由来PDL-MSCを臨床応用するための基礎医学的知見を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】胎児・新生児医学

【研究領域課題番号】17H04236 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヒト羊水幹細胞 / 間葉系幹細胞 / 早産 / 敗血症 / 抗炎症作用 / 脳性麻痺 / 再生医療 / 幹細胞治療 / ニューロスフェア / 未熟児医学 / 幹細胞 / 羊水

【研究成果の概要】

本邦では年間5万件の早産分娩が存在し約4割が子宮感染に起因するが，早産とその合併症に対する新規治療法の開発は周産期領域の課題である．
我々は，リポポリサッカライドを生後3日目のラットに投与し早産新生仔敗血症モデル動物を作成し，このモデルを用いてヒト羊水幹細胞の治療効果を検討した．その結果，予想に反して，リポポリサッカライド投与後に羊水幹細胞を投与しても治療効果は認めず，事前投与を行った時のみ，生存率改善・炎症性サイトカインの減少・炎症性多臓器障害の軽減などの治療効果を認めた．そして，治療機序として，羊水幹細胞とマクロファージを含む腹腔内細胞凝集体が治療に寄与していることが推察された.

【研究の社会的意義】

早産合併症には現時点で有効な治療法がない．しかし，我々は本研究課題を通じて，胎児由来のヒト羊水幹細胞が早産合併症に治療効果を有する可能性を見出した．この治療効果はヒト羊水幹細胞の抗炎症作用に起因すると考えられ，生存率の改善という最大のエンドポイントを改善した点は今後の臨床応用に向けて重要な結果であると考える．
また，治療機序に関する検討も進んでおり，抗炎症作用や細胞凝集体の寄与などといった，これまで明らかになっていないヒト羊水幹細胞による炎症性疾患の治療機序の解明に繋がる可能性がある．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,900千円 (直接経費: 13,000千円、間接経費: 3,900千円)

【研究分野】獣医学

【研究領域課題番号】16H05037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬 / 脊髄再生医療 / 間葉系幹細胞 / 脊髄損傷 / 再生医療 / 肝細胞成長因子 / 静脈投与 / 生体内イメージング / 骨髄間葉系幹細胞 / In vivo イメージング

【研究成果の概要】

新規犬間葉系幹細胞を用いた犬の脊髄再生医療の開発を目指し、急性期および亜急性期脊髄損傷モデルに対するBM-PAC移植の治療効果をBM-PACからの液性因子分泌に着目して評価・解析した。急性期および亜急性期脊髄損傷に対しBM-PACを静脈内投与したところ、BM-PACは損傷部位へHomingした。また、急性期では肝細胞成長因子（HGF）、亜急性期では血管内皮細胞増殖因子（VEGF）などの液性因子の分泌を開始、組織損傷抑制・保護効果あるいは組織再生効果を発揮することで、運動機能回復の促進に寄与することが示唆された。本研究から、BM-PACの静脈内投与による犬の脊髄再生医療の臨床応用が期待できる。

【研究の社会的意義】

犬では脊髄損傷が多く、重症例では術後の歩行回復が十分ではなく、動物のみならず飼主のQOLも著しく低下する。近年、これらの症例に対するMSCを用いた脊髄再生医療が導入されるようになっているが、科科学的根拠に不足し、MSC移植の効果に期待した盲目的な投与が多くなっている。本研究は、独自に見出した新規MSCであるBM-PACを用い、脊髄再生医療に利用できる性質を有していること、また、動物モデルを用いた有効性・安全性試験を通し、移植法の妥当性、運動機能回復効果が得られるメカニズムについて明らかにし、科学的根拠に基づいた犬の脊髄再生医療を開発に貢献した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】16K11676 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

造血-間葉相互作用 / 間葉系幹細胞 / 造血幹細胞 / ステムネス / 幹細胞niche / 再生医療 / 幹細胞シグナル / RNA-Seq / トランスクリプトーム解析 / ステムネスシグナル / 幹細胞誘導型再生骨 / MSCニッシ / 歯学

【研究成果の概要】

本研究では、造血幹細によって誘導されるMSCのステムネスシグナルを解明し、組み換えヒト(rh)BMP-2で誘導する再生骨に、シグナル関連分子を活用した、骨形成の促進と維持を実現する方法を確立し、長期に骨量・骨質を維持できる機能的骨再生を実現することで骨再生への応用を目指すとともに、口腔外科再生医療の発展の一助とすることを目的として、研究を実施した。In vivo, in vitroでの検討結果から、幹細胞特性の維持、骨髄細胞の動員、定着させるためには、ステムネス因子の持続的な徐放が必要となる。そのため、因子の徐放に関して、今後も検討していく必要があると考える。

【研究の社会的意義】

骨髄間葉系幹細胞（MSC）は、現在有用とされているマーカーで分離したとしても、その多くは特性を異とする細胞集団であるため、極僅かであるMSC本体の特性を解明することは非常に困難である。しかしながら申請者らは、造血幹細胞（HSC）とMSC間に幹細胞間の相互作用が存在することに注目し、それにより幹細胞同士が相互の特性維持に寄与している可能性を示唆した。これまで、MSCからHSCにシグナルが伝達されていることが報告されていたが、本研究では、HSCからMSCへのシグナルも伝達されていることがわかった。この知見は、幹細胞間に特異的であり、幹細胞ニッシ研究を加速させるうえで非常に重要な結果であると考える。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】16K11675 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

薬剤性顎骨壊死 / iPS細胞 / 細胞治療 / MSC / 顎骨壊死 / 間葉系幹細胞 / 再生医療 / 骨粗鬆症 / 薬剤関連性顎骨壊死 / iPS細胞由来間葉系幹細胞 / iPS / 薬剤関連顎骨壊死

【研究成果の概要】

細胞移植治療に用いられるMSCの多くは骨髄または脂肪組織から採取したものである。しかし特性の高いMSCは大量には採取できない。しかも、MSCは培養により急速に脱分化し細胞特性を喪失する。さらに高齢者ではMSCの増殖性が低下していることから、全年齢を対象とした治療方法にはなり得ない。そこでMSC供給源として人工多能性幹細胞(iPS細胞)に着目し、iPS細胞から細胞治療に使用するMSCを作製した。このとき血小板由来成長因子受容体をコードするPdgfr遺伝子の発現量を指標として、成熟度が異なるMSCを製造した。このMSCを顎骨壊死疾患モデルマウスに投与して治療効果を評価した。

【研究の社会的意義】

本研究の特色はiPS細胞の分化誘導技術とモデル動物作製技術を組み合わせることで、これまでの骨髄由来MSCを用いた方法では不可能だった大量かつ分化段階の異なるMSCをiPS細胞から誘導し、薬剤性顎骨壊死(ARONJ)モデル動物を用いて細胞移植治療の各種検討をおこなうことでARONJに対する細胞移植治療の有用性を実証することにある。本研究で得られた成果は、口腔外科領域のみならず、脳神経外科、整形外科や形成外科など、骨再建を担う他科においても有意義な知見となるものであり、広く医療に貢献するものと考えている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】獣医学

【研究領域課題番号】26850192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

間葉系幹細胞 / 犬 / 骨髄 / 再生医療 / 犬骨髄間葉系幹細胞 / 肝細胞成長因子 / 骨髄脂肪 / 幹細胞治療 / 骨髄間葉系幹細胞 / 脂肪細胞 / 肝細胞成長因子（HGF）

【研究成果の概要】

天井培養法により、犬骨髄中の脂肪細胞周囲に付着する細胞から、間葉系幹細胞を得た。この細胞は従来の犬骨髄間葉系幹細胞と比較し、幹細胞特性に優れており、骨髄脂肪細胞周囲細胞（BM-PACs）と命名した。BM-PACsは強力な組織修復因子である肝細胞成長因子（HGF）の分泌能に優れることを明らかにした。皮膚欠損モデルに対して、BM-PACsを局所投与したところ、投与後のBM-PACsにおけるHGF発現を認めた。また、BM-PACsを全身（静脈内）投与したところ、損傷部への遊走能を示した。以上から、炎症を伴う組織損傷に対するBM-PACsを用いた幹細胞療法は、HGFを介した組織治癒効果が期待できた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】25670847 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ステムセル・レザバー / 間葉系幹細胞 / 造血幹細胞 / 骨再生 / 再生医療 / 異所性骨化 / 異所性骨 / BMP-2 / VEGF

【研究成果の概要】

ステムセル・レザバーを具備する機能型再生骨を実現することを目的とし、まずrhBMP-2誘導再生骨に対し、間葉系幹細胞ならびに造血幹細胞を維持する因子およびその投与量を検討した。この条件に基づき、造血幹細胞維持因子を含有し、rhBMP-2を内包する機能型再生骨の試作をおこなった。さらに、マウス皮下移植モデルなどの動物実験モデルを通じて製造条件を確立し、機能型再生骨を作製した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】臨床獣医学

【研究領域課題番号】24580458 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脱分化脂肪細胞 / 骨髄 / 再生医療 / 間葉系幹細胞 / 骨髄間葉系幹細胞 / 脂肪組織由来間葉系幹細胞 / 脂肪由来間葉系幹細胞 / 脱分化

【研究成果の概要】

犬の皮下脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離し、培地を満たしたフラスコ中で天井培養すると脱分化し、間葉系幹細胞（MSC）の性質をもつ、脱分化脂肪細胞（DFAT）が得られた。一方、犬骨髄中の脂肪細胞を用いて同様に天井培養を行ったところ、脂肪細胞周囲の小型細胞が増殖した。この細胞を骨髄脂肪細胞周囲細胞（BM-PACs）と名付け、骨髄間葉系幹細胞（BMMSCs）と比較したところ、増殖能や多分化能、肝細胞増殖因子の発現に優れており、再生医療に有用な新たなMSCであると考えられた。さらに、BM-PACsの軟骨分化能に注目し、バイオ3Dプリンタを用いた犬軟骨の組織培養を試み、犬軟骨様組織の作製に一部成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)

【研究分野】歯科医用工学・再生歯学

【研究領域課題番号】24592965 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

歯周組織 / 再生医療 / 再生医学 / 間葉系幹細胞 / 神経堤細胞 / iPS細胞 / 新規歯周組織再生療法 / 実験的慢性歯周炎 / 組織再生 / 歯周組織幹細胞

【研究成果の概要】

歯周組織の恒常性は局所の歯根膜細胞や歯槽骨細胞によってなされているが、移動してきた幹細胞様細胞が歯周組織の修復と再生に寄与している可能性があることが報告された。これらの細胞は骨髄間葉系幹細胞のマーカー（PDGFRa）を発現していた。歯周組織は発生学的に神経堤細胞にその起源を持つことからiPS細胞から神経堤細胞に誘導し、歯および歯周組織再生療法へつなげることを本研究課題の目標とし、以下の成果を得た。(1)ヒトiPSからの神経堤細胞誘導方法の確立。(2)誘導した神経堤細胞由来間葉系幹細胞の増殖能と骨・軟骨・脂肪・末梢神経系への分化能の確認。(3)誘導した幹細胞が遊走能を有していることが確認できた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】23659938 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医療 / 間葉系幹細胞 / DNAメチル化 / 骨再生医療 / ＭＳＣ / メチル化 / リプログラミング / ＤＮＡメチル化

【研究成果の概要】

本研究の目的は、必要最低限のリプログラミングによって培養間葉系幹細胞(MSC)をリセットし、この細胞を細胞源として用いて安全で確実な再生医療技術を確立することである。本研究では、培養ラットMSCのDNAメチル化をゲノムワイドで解析し、細胞劣化にともなうメチル化変動部位を同定した。DNA脱メチル化刺激を用い、この部位のメチル化状態を改善する方法を検討し、ブタ骨再生モデルに応用した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】22659183 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血栓止血学 / 再生医療 / 血小板 / 巨核球 / 骨髄脂肪変性 / 造血幹細胞 / 間葉系幹細胞 / 脂肪前駆細胞 / 分化誘導 / 細胞運命制御 / 細胞分化運命制御

【研究成果の概要】

巨核球と脂肪細胞の両方への分化能を有する細胞、そしてそれらどちらにも分化しない繊維芽細胞を用いた遺伝子発現解析において差異の認められたいくつかの因子の遺伝子導入細胞を種々のアプローチにより検討した結果、p45NF-E2/Maf G/Maf Kが巨核球分化決定因子であり、脂肪分化決定因子CEBPalphaの共発現の条件下では巨核球分化が抑制される事を認めた。したがって、p45NF-E2/Maf G/Maf KとCEBPalphaが巨核球と脂肪の分化スイッチ機構において重要な役割を有する事を見いだした。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,290千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】21659462 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

間葉系幹細胞 / 再生医療 / MPCポリマー / 分化 / 軟骨

【研究成果の概要】

本研究では、間葉系細胞の純化・濃縮による再生組織の特性向上を目的として、細胞接着阻害物質MPCポリマーを用いて細胞接着能の違いにより細胞を分取する培養プレート(MPCプレート)を作製し、接着性が高い間葉系細胞を選択的に回収して幹細胞特性の向上(SP細胞濃縮)を図る。最終年度である本年度では、1)MPCプレートで分離したMSCの増殖能、分化能の評価、2)MPCプレートによるSP分画濃縮の有用性検証、をおこなった。1)MPCプレートで分離したMSCの増殖能、分化能の評価、については、前年度の研究で選定されたMPCポリマー濃度5%のプレートを用いて、骨髄細胞を2500細胞/cm^2で播種して継代培養し、一継代10倍程度の良好の増殖を得た。また、多分化能に関しては、MPCプレートを用いて培養したP2,5の細胞と、MPCプレートを用いなかった対照群の細胞を比較検討したところ、MPCプレートで培養した細胞では、骨芽細胞系マーカーであるALPやRUNX2、軟骨細胞系マーカーではCOL2、COL1O、Sox9などの発現が上昇しており、MPCプレートにより、接着性が高い間葉系細胞を選択的に回収でき、幹細胞特性が向上していることが示唆された。2)MPCプレートによるSP分画濃縮の有用性検証、では、MPCプレートを用いて分離したMSCと対照細胞を用いて再生骨を作製した。ラット骨髄細胞をMPCポリマー濃度5%のプレートに播種して細胞を分離し、さらに、10%FBS含有培養液でP2まで継代培養し、人工骨とともにラットの背部に移植した。MPCプレートで分離したMSCを用いた再生骨は、対照細胞を用いて再生骨に比べ、組織学的にも生化学的(アウカリホスファターゼ活性)にも優れ、MPCプレートによる幹細胞特性の向上が検証された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】21659069 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医療 / 臍帯 / 組織幹細胞 / ES細胞 / CD34陽性細胞 / 間葉系幹細胞 / VSEL / 臍帯血

【研究成果の概要】

臍帯血中に、組織幹細胞のソースとなるES様細胞(VSEL)があるのではとの推察から、臍帯血中のES様細胞マーカーの検討を行った。確かにSSEA3陽性のRBC大のN/C比の高い芽球様小細胞を認めたが、数が非常に少なく更なる解析には至らなかった。一方、共培養のフィーダーと考えていた臍帯由来間葉系幹細胞に、SSEA3/4陽性細胞や遺伝子レベルでES特異的なマーカーの発現を認め、単独にても再生医療のソースとして期待された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】3,270千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 270千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】18591673 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

腱・靭帯骨付着部 / 再生医療 / 間葉系幹細胞 / アポトーシス / 間葉系肝細胞 / 靭帯 / 腱 / 骨付着部

【研究成果の概要】

靭帯・腱付着部の損傷に対して骨髄間葉系細胞を用いて構造再生を促進する基礎的研究を行った。実験は家兎の上肢肩関節に欠損部を作製し、まずは自然修復過程を観察した。靭帯・腱付着部のみの損傷では隣接組織である滑液包に存在する滑膜細胞からの反応が重要であることが分かった。次に骨髄間葉系細胞の欠損部への移植に対する修復促進過程を観察したが、有意な成果を得ることができなかった。同様に骨髄間葉系細胞による反応を確認するために靭帯・腱付着の損傷作製時にその下層の骨髄まで損傷させた場合、骨髄からの反応により修復過程が促進されることが確認された。以上から骨髄間葉系細胞による靭帯・腱付着部 の構造再生作用が明らかになった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2008

【配分額】4,040千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 540千円)