【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】16K15700 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮 / 脱細胞化 / 再生 / STAT3 / 着床 / 細胞外基質 / 妊娠 / 組織再生 / マウス / 卵巣ホルモン / 子宮再生 / 月経 / 分娩後 / 再生医学

【研究成果の概要】

脱細胞化した生体組織を足場として機能的組織を作成する新しい臓器再生法を用いて研究を行った。野生型マウスを用いて細胞外基質のみからなる子宮の脱細胞化担体(DUM)を作成し別の野生型マウス子宮に人工的欠損部に移植した。移植後1か月で子宮全層が完全再生され、正常産仔を産出できる機能的子宮であることが判明した。着床に必須の転写因子STAT3の子宮特異的欠損マウスをレシピエントとしてDUMを移植したところ、子宮上皮・間質・筋層いずれも再生が顕著に遅延し、子宮のSTAT3はDUM移植モデルにおける子宮再生において重要な因子であることが示された。脱細胞化技術は着床障害患者の新規治療戦略の基盤技術となりうる。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】16H05494 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

皮膚 / 再生 / 胎仔 / twist2 / 再生医学 / マウス / 再生医療 / 遺伝子改変マウス

【研究成果の概要】

マウス胎生13日までの胎仔に作成した創傷は、瘢痕を残すことなく完全に再生し、胎生15日以降に作成した創傷は、肌理は再生せず、また真皮が線維化し瘢痕を残して治癒する。創傷作成後の組織切片からレーザーマイクロダイセクションとマイクロアレイを用いて詳細に発現遺伝子の比較を行い、再生を促すあるいは瘢痕形成を起こさせる因子の絞り込みを行った。　同時に皮膚が完全に再生するマウス胎生１３日の創傷部位に特異的に発現が認められたtwist2のノックアウトマウスを購入し、飼育して繁殖させ、これらの妊娠マウスを使用し、胎生13日および胎生15日胎仔マウスに創傷を作成し、創傷作成後の創閉鎖、形態の変化を調べた。

【研究の社会的意義】

本研究により、マウス胎仔皮膚再生に関与する分子が、皮膚の再生に関与している可能性が示唆された。今後、これらを操作することで、瘢痕を抑制する分子の開発につながる可能性が示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13F03750 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 細胞・組織 / シグナル伝達 / 肝臓 / 発がん / 胆管 / 組織幹細胞 / 再生 / 幹/前駆細胞 / ニッチ / 細胞間相互作用 / シグナル / 線維化 / 肝がん

【研究成果の概要】

重篤な、あるいは、慢性的な障害を受けた肝臓では、未分化性を有する特殊な肝前駆細胞（LPC）が活性化して組織の再生に寄与している。LPCは、肝線維化や肝がん等の病態に関連することが長らく指摘されているものの、その実態や機序は未解明である。本研究課題では、LPCと、これの制御に関わるニッチとの相互作用に注目して、両者の性状・制御機構および肝臓の病態における役割の一端を明らかにすることを目的とした。
前年度までに、脂肪肝・線維化・LPCの誘導（胆管増生）を経て早期に肝がん発症にいたる肝病態モデルマウスを確立した。また、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いて、成体マウス肝臓の肝細胞をはじめとする各種構成細胞に遺伝子導入する系の構築を行った。平成27年度には、これらの実験系と、Cre-loxPシステムを用いた細胞系譜追跡系を組み合わせることで、肝がん細胞の起源・LPCの肝がんへの寄与を解析する実験を行った。その結果、上記肝発がんモデルにおいて形成される腫瘍の大部分は、肝細胞に由来することを明らかにした。一方で、腫瘍形成に先立つ段階において、肝細胞由来のLPCが出現することを示唆するデータも得られた。このような「肝細胞由来のLPC」が肝がんの起源となる可能性について、引き続き詳細な解析を進めている。
また、上述したAAVベクターによる遺伝子導入系を改変することで、マウスの胆管上皮組織での遺伝子操作を可能とする、新たな遺伝子導入系の構築に成功した。その効率および細胞種特異性を、さらに改善するための工夫・検討を行っている。
以上２点の研究成果について、国際誌にて発表するための準備を進めている。

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】22390332 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 毛包 / 再生医療 / 再生 / 皮膚

【研究成果の概要】

本研究は、これまで申請者らが行ってきたマウス胎仔の皮膚再生現象の解析、マウス線維芽細胞の非接着培養による毛包誘導能の獲得の研究で得られた知見を基に、ヒト由来培養線維芽細胞およびヒト由来培養表皮角化細胞を用いて、皮膚付属器を含めた完全なヒトの皮膚を再生させることを目的とした。毛包、皮膚付属器を含めた完全な皮膚を再生させる至適培養条件を確立し、また、その分子機構についての解明を行った。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】18,980千円 (直接経費: 14,600千円、間接経費: 4,380千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】19390455 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

皮膚 / 再生 / 付属器 / 細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

様々な発生段階のマウス皮膚から真皮細胞と筋膜細胞を採取し表皮細胞と混合移植を行い、その際の再生細胞の局在、全細胞に対する割合を免疫染色で確認し、scid mouse背部皮膚全層欠損創への表皮真皮混合移植モデルを用いて皮膚再生能の相関性を調べた。その結果、胎仔の真皮細胞に相当する細胞は減少したが、成獣においても存在した。週令数が増加するとともにscid mouse皮膚全層欠損創への混合移植による皮膚付属器の再生率は減少した。ヒトでも同様の細胞は存在した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】18,460千円 (直接経費: 14,200千円、間接経費: 4,260千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】17209053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 子宮筋 / 幹細胞 / 動物モデル / 再生医学 / 子宮内膜症 / 免疫不全マウス / 再生

【研究成果の概要】

本研究では、子宮内膜、子宮平滑筋といった雌性生殖器官における成体幹細胞システムの基礎的解明とともに、臓器再生と疾患モデル構築の技術開発という応用面に重点を置いて、以下の3点について研究を進めた。以下がその成果の概要である。
A.雌性生殖器官組織における幹細胞の分離・同定および幹細胞特性の解明
Side population(SP)法を用いて、子宮内膜と子宮平滑筋からSP細胞を純化・精製する方法を確立し、それぞれが未分化状態にあることに加えて、自己増殖能や多分化能といった幹細胞様特性を有することを明らかにした。
B.雌性生殖器官幹細胞を用いた臓器構築とその再生医療への応用
ヒト子宮筋より分離したSP細胞は、重度免疫不全マウス子宮においてヒト子宮筋を構築する能力を有することを示した。さらに、同マウスの腎被膜下に少数のヒト内膜分散細胞を移植することにより、ユニークな血管新生を伴い、且つホルモン反応性変化を呈する内膜組織が再構築されることを示した。さらに、その再構築内膜の振る舞いを、蛍光・発光蛋白マーカーを用いて、非侵襲的リアルタイムに観察可能なシステムを構築し、内膜再生モデルとしての有用性を示した。
C.雌性生殖器官幹細胞を用いた疾患モデルの構築
上記のヒト内膜再生モデルマウスは、内膜症モデルマウスとしてのポテンシャルを有しており、内膜症の発症・進展メカニズムの解明や内膜症治療薬の開発において有用な研究ツールになる可能性を示した。
内膜細胞あるいはその幹細胞から胚受容能を有するヒト内膜組織を再構築しin vitro着床システムの確立を目指しているが、その実験ツールとして、ヒト絨毛細胞株スフェロイド(胚に相当)と内膜腺上皮株を用いたin vitro着床モデルを確立した。また、着床に必須の内膜分化を担う分子メカニズムを明らかにし、それを標的にした着床制御に必要な基盤データも得た。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】49,920千円 (直接経費: 38,400千円、間接経費: 11,520千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】15390452 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胚性幹(ES)細胞 / 骨分化 / 軟骨分化 / 分化十分条件 / 培養方法 / 再生医学 / 骨 / 軟骨 / 再生 / 胚性幹細胞 / 分化誘導 / 幹細胞 / 胚性幹細胞(ES)

【研究成果の概要】

ラットI型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウス、マウスII型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウスを、それぞれ野生型のマウスと交配させて胚盤胞を分離し、そこからES細胞を樹立した。また、上記トランスジーンを発現するレトロウイルスを作成し、これを野生型ES細胞に感染させて株を樹立した。これらのES細胞は、骨芽および軟骨細胞に分化したときにのみ蛍光を発するので、分化誘導因子のスクリーニングに細胞センサーとして利用した。骨芽分化誘導因子としては、BMP受容体、Hhのシグナル伝達分子であるSmo、Wntの転写因子であるLEF-1、Runx2の発現アデノウイルスを作成し、上記ES細胞センサーに網羅的に組み合わせて加え、Runx2とBMPシグナルの組み合わせが相乗的に強力に骨芽細胞分化を誘導することを見出した。軟骨分化誘導因子としては、BMPおよびSoxシグナル伝達系をES細胞センサーに加え、Sox9と、Sox5あるいはSox6の組み合わせが強力に軟骨分化を誘導することを見出した。これらの実験により、骨芽あるいは軟骨細胞分化誘導のシグナルの最適化を行った。
また、樹立したES細胞を、最適条件で分化させることなく、平面培養で増殖させるための至適条件(継代のタイミングと、コロニーサイズ)を決定した。さらに将来ヒトES細胞を使うことを睨んで、カニクイザルのES細胞を購入し、これを用いて培養・分化方法について経験を積んだ。
上記のごとく決定した至適条件で分化した骨芽様細胞および軟骨様細胞を、それぞれアテロコラーゲンフィルム上に播種して培養し、十分な基質をつくらせ、基質の石灰化及び、トルイジンブルー染色でのメタクロマジーを確認した。このシートを骨・軟骨欠損モデルマウスの欠損部に移植し、移植後1〜4ヵ月後に麻酔後屠殺し、移植部分を組織学的、免疫組織学的に観察したところ、骨欠損のマウスにおいては、良好な再生誘導が見られたが、軟骨欠損に関しては、有意な治癒効果が見られなかった。この原因としては、軟骨分化誘導刺激がまだ十分に最適化されていない可能性が考えられ、今後他のシグナル経路との組み合わせを考慮してスクリーニングしていく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12307016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 骨髄 / 心筋細胞 / 再生 / 心不全 / 細胞分化 / 細胞移植 / 再生医学 / 骨髄細胞 / 発生

【研究成果の概要】

本研究では骨髄間質細胞を分化誘導することにより心筋細胞を作製し、心不全治療に応用しうるレベルに至るまでの基礎研究を行った。今回の一連の研究を通して、(1)骨髄中の多分化成体幹細胞を用いることにより心筋細胞が分化誘導できること、(2)この現象はマウスのみでなく、ヒトの骨髄成体幹細胞を用いても再現できること、(3)骨髄由来の心筋細胞は胎児期心室筋の表現型を取ること、(4)分化当初は洞結節型の活動電位を呈するが、分化とともに心室筋型の活動電位を呈すること、(5)交感神経α1受容体を発現し、心肥大作用を伝達すること、(6)交感神経神経β受容体を発現し、陽性変時作用、陽性変力作用を伝えること、(7)副交感神経ムスカリンM2受容体を発現すること、(8)蛍光色素GFPと心筋特異的プロモーターを使用することにより、心筋細胞のみを単離出来ること、(9)単離した再生心筋細胞を心臓内に移植すると、心臓内で長期間生着出来ること、(10)このような幹細胞は心筋梗塞などの心筋の壊死炎症がある状況では拘束部位に移動し、心筋やほかの細胞に分化する能力を持つこと、(11)ある種のサイトカインは骨髄から幹細胞の移動に積極的に働くこと、(12)幹細胞と心筋細胞の共培養は幹細胞の心筋分化を誘導する可能性のあること、(13)心筋分化能のある骨髄成体幹細胞の表面抗原はヒトとマウスで異なること、(14)ヒトの骨髄成体幹細胞はin vitroで長期間培養するとテロメアの長さの関係で細胞増殖できなくなるが、いくつかの遺伝子導入を行うことにより、細胞増殖できるようになることなどが明らかとなった。このことは骨髄成体幹細胞から分化誘導した心筋細胞は生体内の心筋とほぼ同等の性質を持ち、心筋細胞移植が一歩現実に近づいたことを意味するものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】43,500千円 (直接経費: 37,200千円、間接経費: 6,300千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12557096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖 / 細胞分化 / サイトカイン / 肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から純化された肝幹細胞画分であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞を回収し、これらのクローナルな培養系を用いて、肝細胞および胆管細胞への分化誘導能を有する新規サイトカインのスクリーニングを行うことを目的として研究を行った。肝幹細胞から胆管細胞への分化誘導能を有する培養上清を得て、さらに、この培養上清の特定分子量分画にc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の増殖抑制活性が限定的に存在することを確認した。この分子量分画から活性タンパク・ペプチドの精製を試みたが、結果として培養液中の血清の存在が困難要因となり精製には至らなかった。一方、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞に与える既知の各種サイトカイン、細胞外マトリックス、転写因子C/EBPsの影響に関するスクリーニング解析により、hepatocyte growth factor(HGF)やC/EBPsが肝幹細胞の初期分化に重要な役割を果たしていることを明らかにした(Development 130:2513-2524,2003)。
今後、肝幹細胞の分化・増殖機構を精度の高い解析系を用いて、ひとつひとつ丹念に検証していくとともに、実用化技術の開発に向けた疾患モデル動物における治療効果についても並行して検討する必要がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】9,800千円 (直接経費: 9,800千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12307023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 肝臓 / 幹細胞 / 再生

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から肝幹/前駆細胞画分であるc-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞を選別・回収する技術を確立した。さらに、肝幹細胞の純化を進め、胎児肝臓中の僅かに0.3%を占めるにすぎないc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定的に肝幹細胞が存在することを明らかにした。そして、このc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞は、多分化能を維持したまま増殖可能で自己複製能を有していること、膵細胞や腸管上皮細胞など他の細胞系列の細胞へ分化する可塑性を有していることなどを明らかにした。これらのc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞が有する特性は、この細胞が厳密に定義し得る多能性肝幹細胞であることを如実に示している。これは、今まで概念としてしか捕らえられていなかった肝幹細胞の実体を初めて明確にしたという点で、幹細胞生物学的に意義の深い研究成果であったといえる。また、応用科学的側面からは肝幹細胞の分離・操作の基盤技術が確立されたといえ、今後の先進医療への応用が期待できる研究成果である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】21,310千円 (直接経費: 19,000千円、間接経費: 2,310千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】11877192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学 / 自己修復能

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。昨年度までの研究により、c-Kit-CD49f+CD29+ CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在し、肝細胞と胆管細胞という異なる細胞系列へと分化し得ることを明らかにした(Hepatology 32(6):1230-1239,2000.)。今年度は、c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞の画分化を段階的にすすめ、自己増殖能をも備えた幹細胞画分を明らかにすることを試みた。その結果、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能、多分化能、自己複製能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)が高頻度に存在することが判明した。また、この肝幹細胞の少なくとも増殖にhepatocyte growth factor(HGF)が必須の因子であることを明らかにした。今後、さらに、純化した肝幹細胞の分化・増殖・自己複製機構を培養系を用いて解析し、「臓器再生」の基盤となる知見および技術を確立する予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)