Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

再生 / 軟骨 / 誘導 / 軟骨形成 / 再生誘導 / 瘢痕組織 / 陳旧性血腫

本研究ではin situにおいてはどのようなサイトカインや増殖因子が軟骨形成を惹起するのかを解明することで、培養元となる軟骨採取を必要としない軟骨再生の誘導方法開発をめざす。
本研究期間内に、まずは血腫形成後に耳介軟骨過形成を来す動物モデルを確立することを目標とした。
具体的にはマウスの耳介軟骨に検証物質を注入するにあたり、適切な器具や注入量、手技、トレース、固定、染色方法　などをはじめにパイロットスタディとして様々検討した。とくに軟骨組織を含む切片の作成にあたっては、試行をくりかえしたが、川本法を採用することで安定した切片作成が可能となった。染色・傾向トレース含め一通りのメソッドを確立させたところで、３群（詳細は論文をもって発表予定）＋コントロール群にわけた５週マウスの耳介軟骨膜下にそれぞれ注入し、一部は蛍光色素によるトレースを行った。１、２、４、８、１２週時点で評価を行い、組織評価を行った。

胚性幹(ES)細胞 / 骨分化 / 軟骨分化 / 分化十分条件 / 培養方法 / 再生医学 / 骨 / 軟骨 / 再生 / 胚性幹細胞 / 分化誘導 / 幹細胞 / 胚性幹細胞(ES)

ラットI型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウス、マウスII型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウスを、それぞれ野生型のマウスと交配させて胚盤胞を分離し、そこからES細胞を樹立した。また、上記トランスジーンを発現するレトロウイルスを作成し、これを野生型ES細胞に感染させて株を樹立した。これらのES細胞は、骨芽および軟骨細胞に分化したときにのみ蛍光を発するので、分化誘導因子のスクリーニングに細胞センサーとして利用した。骨芽分化誘導因子としては、BMP受容体、Hhのシグナル伝達分子であるSmo、Wntの転写因子であるLEF-1、Runx2の発現アデノウイルスを作成し、上記ES細胞センサーに網羅的に組み合わせて加え、Runx2とBMPシグナルの組み合わせが相乗的に強力に骨芽細胞分化を誘導することを見出した。軟骨分化誘導因子としては、BMPおよびSoxシグナル伝達系をES細胞センサーに加え、Sox9と、Sox5あるいはSox6の組み合わせが強力に軟骨分化を誘導することを見出した。これらの実験により、骨芽あるいは軟骨細胞分化誘導のシグナルの最適化を行った。
また、樹立したES細胞を、最適条件で分化させることなく、平面培養で増殖させるための至適条件(継代のタイミングと、コロニーサイズ)を決定した。さらに将来ヒトES細胞を使うことを睨んで、カニクイザルのES細胞を購入し、これを用いて培養・分化方法について経験を積んだ。
上記のごとく決定した至適条件で分化した骨芽様細胞および軟骨様細胞を、それぞれアテロコラーゲンフィルム上に播種して培養し、十分な基質をつくらせ、基質の石灰化及び、トルイジンブルー染色でのメタクロマジーを確認した。このシートを骨・軟骨欠損モデルマウスの欠損部に移植し、移植後1〜4ヵ月後に麻酔後屠殺し、移植部分を組織学的、免疫組織学的に観察したところ、骨欠損のマウスにおいては、良好な再生誘導が見られたが、軟骨欠損に関しては、有意な治癒効果が見られなかった。この原因としては、軟骨分化誘導刺激がまだ十分に最適化されていない可能性が考えられ、今後他のシグナル経路との組み合わせを考慮してスクリーニングしていく予定である。

インスリン / IGF / IRS / 骨 / 軟骨 / 再生 / 骨粗鬆症 / 骨折 / 骨再生 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / IRS-1,-2 / IGF-I

インスリンは骨・軟骨組織における重要な同化因子であり、後縦靭帯骨化症患者の骨化傾向に血中のインスリンレベルが重要な役割を果たしていることが明らかとなった(J Bone Joint Surg Am 83:1537-1544,2001)。インスリンとIGF-Iの受容体キナーゼ共通の基質であるインスリン受容体基質(IRS-1,IRS-2)はこれらの細胞内情報伝達に必須の分子である。我々は既に、IRS-1欠損マウスの検討によりIRS-1シグナルが骨代謝回転の維持に必須であることを報告した(J Clin Invest105:935-943,2000)。また、IRS-1欠損マウスの骨折治癒は野生型マウスに比べて明らかに抑制されており、IRS-1は骨再生にも重要であることが明らかになった。一方、IRS-2欠損マウスは骨形成の低下と骨吸収の亢進というuncoupling状態を呈した。これは、IRS-2シグナルが骨芽細胞においてその骨形成促進作用を亢進させる一方、RANKL発現を抑制することにより、骨形成作用が骨吸収作用を上回るようにバランス維持に働いているためであるためであることが明らかとなった。この両シグナルの総和として、インスリン/IGF-1による骨代謝に対する強力な同化作用が実現されていることが示された。

【研究分担者】
川口浩	東京大学	医学部附属病院	助教授	(Kakenデータベース)
中村耕三	東京大学	医学部附属病院	教授	(Kakenデータベース)
池田敏之	東京大学	医学部附属病院	客員助手	(Kakenデータベース)
筑田博隆	東京大学	医学部附属病院	助手	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
戸辺一之	東京大学	医学部・附属病院	助手	(Kakenデータベース)
中村耕三	東京大学	医学部・附属病院	教授	(Kakenデータベース)
川口浩	東京大学	医学部・附属病院	講師	(Kakenデータベース)
小林篤樹	東京大学	医学部・附属病院	助手
河野慎次郎	東京大学	医学部・附属病院	助手
東成一	東京大学	医学部・附属病院	助手
門脇孝	東京大学	医学部・附属病院	講師	(Kakenデータベース)