【研究領域課題番号】19H03720 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

小児気道狭窄 / ES細胞 / 気管軟骨 / 再生医療 / 胚性幹細胞 / 気管狭窄 / 軟骨 / 移植 / 気道狭窄 / 小児 / 先天性気管狭窄症 / 高圧脱細胞気管 / 軟骨再生

【研究成果の概要】

ヒトES細胞ソースとして分化誘導し、軟骨形成を行った。現在、1.5cmX1.5cm, 厚さ0.5cmの軟骨片の作成に成功している。このヒトES由来軟骨を用いてウサギの気管にパッチ移植を行った。非免疫抑制下では３匹とも移植後１～２週間で呼吸不全死した。病理所見では気管内腔を塞ぐように肉芽形成がみられた。また、ヒトES由来軟骨を４匹のヌードラットに顕微鏡下にてパッチ移植し、１か月にてサンプリングした。ヒトES由来軟骨はラット気管としてairタイトが保たれ、機能的に有効であった。さらに吻合部にはレシピエント（ラット）とドナー（ヒト）の軟骨細胞の癒合がみられた。更に１匹ではあるが、家畜ブタにヒトES由来軟骨をパッチ移植したところ、airタイトは保たれていたが、１か月のサンプリング時に気管支鏡では内腔の狭窄が、また病理ではヒトES由来軟骨の拒絶所見が認められた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】21659462 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

間葉系幹細胞 / 再生医療 / MPCポリマー / 分化 / 軟骨

【研究成果の概要】

本研究では、間葉系細胞の純化・濃縮による再生組織の特性向上を目的として、細胞接着阻害物質MPCポリマーを用いて細胞接着能の違いにより細胞を分取する培養プレート(MPCプレート)を作製し、接着性が高い間葉系細胞を選択的に回収して幹細胞特性の向上(SP細胞濃縮)を図る。最終年度である本年度では、1)MPCプレートで分離したMSCの増殖能、分化能の評価、2)MPCプレートによるSP分画濃縮の有用性検証、をおこなった。1)MPCプレートで分離したMSCの増殖能、分化能の評価、については、前年度の研究で選定されたMPCポリマー濃度5%のプレートを用いて、骨髄細胞を2500細胞/cm^2で播種して継代培養し、一継代10倍程度の良好の増殖を得た。また、多分化能に関しては、MPCプレートを用いて培養したP2,5の細胞と、MPCプレートを用いなかった対照群の細胞を比較検討したところ、MPCプレートで培養した細胞では、骨芽細胞系マーカーであるALPやRUNX2、軟骨細胞系マーカーではCOL2、COL1O、Sox9などの発現が上昇しており、MPCプレートにより、接着性が高い間葉系細胞を選択的に回収でき、幹細胞特性が向上していることが示唆された。2)MPCプレートによるSP分画濃縮の有用性検証、では、MPCプレートを用いて分離したMSCと対照細胞を用いて再生骨を作製した。ラット骨髄細胞をMPCポリマー濃度5%のプレートに播種して細胞を分離し、さらに、10%FBS含有培養液でP2まで継代培養し、人工骨とともにラットの背部に移植した。MPCプレートで分離したMSCを用いた再生骨は、対照細胞を用いて再生骨に比べ、組織学的にも生化学的(アウカリホスファターゼ活性)にも優れ、MPCプレートによる幹細胞特性の向上が検証された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】20300170 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

高分子ゲル / マイクロパターニング / スフェロイド / 軟骨再生 / 微細加工 / 軟骨 / 再生医療 / 組織工学

【研究成果の概要】

スフェロイド間隔を系統的に制御したスフェロイドパターニング技術を開発した結果、軟骨大型化のために最適なスフェロイド設計指針を確定できた。さらに分化誘導のための添加因子を用いることにより細胞外マトリクスの産生能を長期間維持させることに成功した。これらの検討から最適化されたスフェロイド状態において、再生エレメントとして、スフェロイドの体積にして約10倍という大型化を達成した。次にこの技術と合わせ、スフェロイドをより実際的な移植可能な材形へと展開するためのマトリックス材料の設計と合成を行った。このような一連の実験を統合し、運動器系組織の再生技術として開発を進めた結果、関節軟骨における動物実験において移植する構造体として十分機能する再生エレメントであることを示した

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】18,980千円 (直接経費: 14,600千円、間接経費: 4,380千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】17591552 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

cyclic GMP / 軟骨 / 再生医療 / 軟骨内骨化 / 軟骨分化 / cGKII

【研究成果の概要】

cGKllは、ヒトにおいてもマウスにおいても骨成長に重要であることが知られているCNP/cGMPシグナルの下流に位置するキナーゼであり、そのキナーゼ活性を喪失した自然発症型変異ラットKMlは軟骨細胞の肥大分化障害によって四肢短縮を呈する。
cGKllの標的遺伝子の同定する研究では、軟骨肥大化関連分子の中からcGKllのリン酸化標的をスクリーニングしたところ、古典的Wntシグナル関連分子であるglycogen synthase kinase-3β(GSK3β)が強力にリン酸化されその活性が抑制された。軟骨細胞株ATDC5にcGKllを過剰発現した場合も、GSK3β活性阻害剤であるLiClを添加した場合もCOL10の発現は強力に誘導されたが、cGKllによってリン酸化を受けない恒常活性変異型GSK3β(GSK3βS9A)を共発現させるとcGKllによる肥大分化は抑制された。また、cGKll過剰発現はβ-cateninの分解を抑制して核内への移行を誘導し、同時にTCF promoter活性を上昇させたが、これらはすべてGSK3βS9Aの共発現によって回復した。続いてcGKll欠損マウス(cGKll-/-)の骨軟骨を解析すると、軟骨細胞肥大化の障害による成長板の増高と四肢の短縮が見られた。一方、GSK3β-/-マウスは胎生致死であったがGSK3β+/-マウスは正常に成長した。そこでcGKll-/-にGSK3β+/-マウスを交配してダブルノックアウトマウス(cGKll-/-;GSK3β+/-)を作出したところ、cGKll-/-の成長板増高と成長障害が有意に改善された。cGKllはGSK3βをリン酸化・不活化することによって古典的Wntシグナルを活性化し、生体内での成長板軟骨細胞の肥大化による骨成長を制御していることが示された。軟骨分化におけるCNPシグナルとWntシグナル間の分子ネットワークの存在が明らかとなった。本研究は国内外の学会で発表し、高い評価を受けた(日本骨代謝学会優秀演題賞、米国骨代謝学会Young Investigator Award、豪州ニュージーランド骨代謝学会Outstanding Abstract AwardおよびYoung Investigator Award)。
軟骨特異的cGKllコンデイショナルノックアウトマウスおよび軟骨特異的cGKllトランスジェニックマウスの作出については、ターゲテイングベクターはすでに構築済みであり、現在cGKll floxマウスおよびcGKllトランスジェニックマウスを作出中である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 300千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】15209049 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

変形性関節症 / ノックアウトマウス / Carminerin / ゲノム疫学 / 再生医療 / 軟骨 / SOX / 炎症 / fractional factorial design / 人工関節 / Runx2(cbfal) / Sox / cyctatin10 / ゲノム

【研究成果の概要】

1)Reverse geneticsからの病態解明へのアプローチ:昨年度までの研究で確立した、マイクロサージェリー技術を用いたマウスの膝関節の靱帯・半月板の切離・切除の組み合わせによる4種類のOAモデル(Osteoarthritis Cartilage 13:632,2005)を組織学的に観察することによって、軟骨の破壊・変性に先行してRunx2やCOL10の発現誘導を伴う軟骨細胞の肥大分化が起こることを解明した(Arthritis Rheum 54:2462,2006)。またこのモデルから、我々がクローニングした遺伝子carminerinがOAによる骨棘形成に関与していることを解明した(Nature Med 12:665,2006)。
2)Forward geneticsからの病態解明へのアプローチ:昨年度までに構築した4つの地域コホート(和歌山山村コホート、和歌山漁村コホート、板橋コホート、新潟コホート)の内、2つについてベースライン調査を終了した。2,164例のX線写真の解析から、膝OA・腰椎OAの有病率が従来の試算よりもはるかにに高いことが明らかとなった(日本人全体に換算すると、膝OAが3080万人、腰OAが3300万人)。また、地域別、性別に分析した結果、OAの有病率が罹患部位(膝と腰)によって異なる疫学特性を示すことが明らかになった。これらの対象者全員からゲノム解析用の採血を行っており、ゲノムワイドスクリーニングの基盤は固まりつつある。
3)軟骨再生のための基礎検討:昨年度までに確立したCOL2-GFP導入細胞による軟骨分化のリアルタモニタリングシステムによって、転写因子Sox5,6,9の組み合わせが非軟骨細胞からでも軟骨分化を誘導する強力なシグナルであることを示し、この標的分子としてS100A1/Bを同定した(EMBO Reports, in press)。にれらの遺伝子をナノミセルを用いて遺伝子導入する方法を開発し、その臨床応用に向けての研究を進めている。
本研究課題を更に拡大・発展させるべく、我々は戦略的OA統合研究計画として、ROAD (Research on Osteoarthritis Against Disability)プロジェクトを樹立した。これらのサブテーマを包括・融合して、OAの分子レベルでの病因を解明し、画期的な予防・治療法を開発することが、ROADプロジェクトの最終目標である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2003 - 2006

【配分額】49,530千円 (直接経費: 38,100千円、間接経費: 11,430千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】15592098 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生軟骨 / 液性因子 / 脱分化 / 顎関節 / 統計的手法 / Cdk6 / CGKII / 細胞分化 / CGK II / 軟骨 / 三次元培養 / 再生医療

【研究成果の概要】

顎関節の再生医療は口腔外科分野における最重要課題のひとつである。本研究では、近い将来での臨床応用を目的として、顎関節領域における軟骨再生のための基礎的研究を行った。内容は(1)再生軟骨組織作成のための基礎的研究、ならびに(2)骨軟骨細胞の分化制御メカニズムの解明とに大別される。(1)については、使用する細胞として、鼻中隔軟骨細胞と耳介軟骨細胞とを選択した。それは、口腔外科の主要な対象疾患である口唇口蓋裂をはじめとする先天奇形に対する手術の際に入手可能であることや、間葉系幹細胞を効率良く軟骨細胞に分化させることが現時点では困難なため、早期の臨床応用には軟骨細胞による再生を目指す方がより現実的である、等の理由による。まず、(1)安全性の面からFBSは用いない、(2)軟骨細胞の特性を維持した状態で1000倍以上の増殖を獲得する、(3)すでに臨床応用実績のある増殖因子を使用する、という三つの基準をもって、増殖因子の組み合わせの最適化を図り、FGF-2、insulinあるいはIGF-Iの組み合わせが最適であることを明らかとした。ついで、脱分化型軟骨細胞を再分化させるための液性因子の組み合わせを網羅的に検索し、BMP-2とinsulin、甲状腺ホルモンの組合せが理想的であることを見出した。また、いくつかのハイドロゲルについて、軟骨再生における足場素材としての特性を検討した。なお、上記の実験で用いた細胞は、顎顔面領域における先天異常の手術に伴い、廃棄される予定だった軟骨細胞を患者の同意に基づき使用させていただいた。また、(2)については、分子細胞生物学的手法により、CGKIIが軟骨分化に重要な機能を有すること、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞の分化においてCdk6が分化抑制因子として重要であることなどを報告し、骨軟骨再生医療の発展に不可欠な骨軟骨細胞の分化増殖メカニズムの解明を行った。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)