【研究領域課題番号】19K08598 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肺線維症 / TGF-β / マウスモデル / 血管内皮細胞 / 肺障害 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

本研究ではTGF-βというサイトカインの活性化の役割について、制御する細胞膜タンパクに注目して変異マウスの人工的肺線維症モデルの実験により検討した。その結果、この細胞膜タンパクを欠失したマウスでは、肺線維化ではなく肺炎症が増悪することが分かり、そのメカニズムもこれまで知られたTGF-βの活性化を介さないことが明らかになった。単一細胞毎の遺伝子の発現を調べる方法により、その炎症抑制作用に関わる細胞種の存在が示唆された。開発中の抗がん剤はこのタンパクを標的としており副作用の面で肺炎症抑制作用との関係を評価すべきと考えられた。

【研究の社会的意義】

肺線維症は感染症など様々な原因による肺の炎症の治癒過程の結果として肺に残る傷跡でありその程度によっては呼吸機能に障害をきたす。線維化に関わる細胞の増殖を抑える分子標的薬の効果が出ているが、どのようなメカニズムが炎症と線維化に関わるか明らかにすることはよりよい治療法を開発するうえでなお必要である。本研究の対象とした膜タンパクを標的とする抗がん剤など創薬が進行している中、今回明らかになった肺炎症抑制作用はその副作用を考慮するうえで重要な知見になったと考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】腫瘍生物学

【研究領域課題番号】15K06831 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 癌 / 転写因子 / TGF-beta / ChIP-seq / スキルス胃がん / がん

【研究成果の概要】

難治がんの一つスキルス胃がんにおいてはtransforming growth factor-β (TGF-β)ファミリーのサイトカインの病態への深い関与が明らかになっている。研究代表者らはこれまでの検討によりそのシグナルおよび下流の転写調節機構は細胞種により大きく異なることを報告してきた。そこで本研究ではTGF-βシグナルの転写因子Smad2/3の結合部位データを用いて、その経時的変化や他のがんとの比較により病態に関わる分子機構を明らかにすることを目的とした。その結果ある標的遺伝子の発現が患者予後に与える影響が他のがんとは異なること、この遺伝子が細胞運動の抑制に働いていることなどを見出した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】25670234 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 転写因子 / ヘルパーT細胞 / 制御性T細胞 / TGFβ / モデル化 / エピジェネティクス / 遺伝子発現制御

【研究成果の概要】

ヘルパーT細胞は免疫制御の中心を担う細胞である。近年、Th1, Th2以外に多くのサブタイプ(Th9, Th17, iTreg等)が存在していることが知られるようになってきた。本研究ではTGFβのシグナル伝達経路を中心にヘルパーT細胞各サブタイプへの分化制御機構の解明を行った。まずTGFβとIL-4によるTh9分化にはSmad2/3に依存し、さらにIRF4との共同作用が必要であることを明らかにした。さらに消化管におけるiTregの誘導には樹状細胞からのTGFβが重要であること、TGFβの産生には腸内細菌によるTLR2-AP1経路とSmad3経路が重要であることを見いだした。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】25221305 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 炎症 / マクロファージ / 制御性T細胞 / 組織障害 / 修復 / 脳梗塞 / 組織損傷 / 修復機構 / スカベンジャー受容体 / 転写因子 / レチノイン酸受容体 / 免疫学 / アレルギー・ぜんそく / TGFβ / 組織傷害 / T細胞 / 生体恒常性 / 細菌 / 自然免疫 / インフラマゾーム / チロシンキナーゼ

【研究成果の概要】

免疫システムは正負のシグナルがバランスを保って進行することで恒常性が維持され、この破綻がアレルギー疾患などの免疫疾患につながる。本研究はこのような免疫応答の恒常性を支えるサイトカインとそのシグナル制御の基本原理の解明し、疾患治療に応用することを目的とする。本研究では免疫を負に制御し炎症応答を収束させる3つの重要な因子を見出した。第一は核内オーファン受容体NR4aで制御性T細胞の発生維持に必要である。第二はSmad転写因子で免疫抑制因子であるTGFβの産生制御を行う。第三は修復性マクロファージで死細胞より放出される因子を処理し炎症を収束させる。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2013-05-31 - 2018-03-31

【配分額】191,880千円 (直接経費: 147,600千円、間接経費: 44,280千円)

【研究分野】腫瘍生物学

【研究領域課題番号】24501311 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

FAIRE-seq / シグナル伝達 / EMT / 乳がん / TGF-beta / ZEB1 / アポトーシス / ゲノム / 癌 / 転写因子 / lncRNA / lincRNA / FAIRE / RNA-seq / オープンクロマチン / TGF-β

【研究成果の概要】

本研究では乳腺上皮細胞の上皮間葉転換EMTにおける遺伝子発現変化を次世代シーケンサーを用いたRNA-seqにより解析するとともに、オープンクロマチン領域の変化につきFAIRE-seqを用いてデータ取得を行った。その結果発現変動を受けるnon coding RNAなどの新規転写産物を同定した。このうちlncRNA-Smad7の抗アポトーシス作用を見いだした。また乳腺上皮細胞に恒常活性RASを発現させTGF-βによりEMTを起こす細胞ではオープンクロマチン領域に違いが生じることを見出した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】腫瘍生物学

【研究領域課題番号】22220013 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / 微小環境 / シグナル伝達 / 血管新生 / リンパ管新生 / がん幹細胞 / 転移 / EMT

【研究成果の概要】

1)TGF-βによって誘導されるEMTに関する研究を行った。これまで我々は転写因子TTF-1がTGF-βシグナルに拮抗し、肺腺がんにおいてEMTを抑制することを明らかにしていた。さらに我々はTTF-1がTGF-β2の発現を抑制することを明らかにしていたが、もう一つのメカニズムとしてTTF-1がSmad3に結合してDNAへの結合を抑え、Smad3の転写活性を抑えることを明らかにした。
2)TGF-βと協調して肺腺がん細胞にEMTを誘導する因子を探索した。その結果、TNF-αがTGF-βと協調してA549細胞にEMTを誘導することが明らかとなった。一方、FGFは単独ではEMTを誘導しないがTGF-βと共存すると正常の上皮細胞にEMTを強く誘導し、活性型の線維芽細胞へと分化させることが明らかとなった。TGF-βとFGFによってEMTを起こした上皮細胞は乳がん細胞に作用して浸潤能を強く促進することが明らかとなった。
3)スキルス胃がんモデルを用いて血管新生機構の研究を行った。我々はすでにOCUM-2MLN細胞でTGF-βシグナルを遮断すると血管新生が亢進してin vivoでの腫瘍形成能が亢進することを明らかにしていた。またその責任分子としてThrobospondin-1を同定していた。今回、我々はTIMP-2がスキルス胃がん細胞ではTGF-β依存的に誘導されること、TIMP-2の発現を人為的に上昇させると腫瘍組織における血管の密度に大きな差異は見られないが、組織における低酸素状態が強く見られることを明らかにした。
4)BMPのがん微小環境に関する研究を行った。BMP-9は血管内皮細胞の増殖をin vitro、in vivoの両方で促進した。しかし、BMP-9の内皮細胞増殖はin vivoではpericyteの増殖を伴っていないことが考えられ、腫瘍の増殖はむしろ抑制されることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2010

【配分額】44,200千円 (直接経費: 34,000千円、間接経費: 10,200千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】22249009 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / チロシンキナーゼ / 転写因子 / ヘルパーT細胞 / 抑制性T細胞 / TGF-β / 炎症 / 免疫応答 / 自己免疫疾患 / TGFーβ / Foxp3 / 胸腺 / TGFβ / RORgammat / インターフェロン / SOCS / アレルギー / STAT

【研究成果の概要】

サイトカインは自然免疫系の細胞や獲得免疫系の細胞を制御する。我々はサイトカインのなかで特にTGFβを中心に病原性のTh17と抑制性T細胞Tregの産生のメカニズムを明らかにした。Tregのマスター遺伝子Foxp3はSmad2,Smad3経路によって誘導され、一方Th17はSmadに依存しない経路によって誘導された。Smad非依存性の経路としてJNK-c-junによってEomesderminという遺伝子が転写抑制される経路を発見した。またサイトカインシグナルの制御因子SOCS1がTregの恒常性維持や抑制機構に必須の役割を果たすことも明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】48,750千円 (直接経費: 37,500千円、間接経費: 11,250千円)

【研究分野】動物生理・行動

【研究領域課題番号】19107002 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脳・神経 / 視覚 / 光 / シグナル伝達 / サーカディアンリズム / 転写因子 / タンパク質リン酸化 / 松果体 / 網膜 / 視細胞 / 動物生理 / 化学 / 位相シフト / 視覚網膜 / 位相シフト制御 / TGF-β / 翻訳後修飾

【研究成果の概要】

本研究では、1)松果体と網膜の光受容ニューロンの特異性を規定する遺伝子ネットワーク、2)概日時計の位相制御機構、3)網膜光受容細胞の光応答特性、という3課題を設定し、動物光受容システムの統合的理解を目指した。その結果、1)松果体特異的な遺伝子発現を司る転写因子等を発見、2)概日時計の位相制御に関わる複数因子を同定して位相決定機構を解明、3)桿体と錐体の光応答特性の違いを生み出す分子機構を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2007 - 2011

【配分額】106,080千円 (直接経費: 81,600千円、間接経費: 24,480千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】18109005 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / チロシンキナーゼ / 転写因子 / ヘルパーT / 細胞 / 樹状細胞 / Ras c-fos / ヘルパーT細胞 / インターフェロン / SOCS / 炎症 / アレルギー / 自己免疫疾患 / STAT / 負の制御 / 免疫制御 / アレルギー自己免疫疾患 / TGFβ / 抑制性T細胞

【研究成果の概要】

サイトカインはマクロファージや樹状細胞などの自然免疫系の細胞やT 細胞などの獲得免疫系の細胞を制御する。我々はサイトカインシグナルを制御するSOCSファミリーとSpred/Sproutyファミリーを中心に主に遺伝子改変マウスを用いて個体レベルでの解析を行って来た。その結果SOCS1やSOCS3は転写因子STATを制御することで、ヘルパーT細胞(Th17やTreg)の分化を調節することを見いだした。またSpred1が神経芽細胞腫の原因遺伝子であることなどを明らかにした。さらに新規のシグナル制御機構としてcAMPによるTLRシグナルの抑制にc-fosが関与することを見いだした。またSmad2/3がTGFβによる免疫抑制に必須であることも見いだした。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2006 - 2009

【配分額】107,250千円 (直接経費: 82,500千円、間接経費: 24,750千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】18209051 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 子宮内膜症 / シグナル伝達 / proteinase-activated receptor / TGFβ / IL-6 / IL-17 / MAPキナーゼ / Th17 / IL-8 / AMPキナーゼ / メトホルミン / 着床 / 自然免疫

【研究成果の概要】

子宮内膜とその関連疾患についてのシグナル伝達機構とその制御について臨床にフィードバックできる多くの貴重なデータを得ることができ、周辺の事項も含めて発展的に理解を深めることができた。子宮内膜症に関しては、発症機序について多くの新しい知見を得ることができ、さらに、アポトーシスやT細胞免疫に新たな分子標的を見出すことにより不妊症治療につながる新たな展開をもたらした。一方、正所性子宮内膜に関しては、月経周期にともなう組織学的変化を支える種々のシグナル伝達機構や、その制御異常による不妊症などについて多くの知見を得ることができた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】49,790千円 (直接経費: 38,300千円、間接経費: 11,490千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】17591115 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 細胞、組織 / MAPキナーゼ / 発生異常 / p38 / ERK / 嚢胞 / 伸展 / 細胞・組織 / 腎臓 / 胎生期尿路閉塞 / 線維化 / TGF-β / 多発性嚢胞腎 / 尿管芽細胞 / 細胞伸展

【研究成果の概要】

本研究は胎生期尿路閉塞がシグナル伝達の中核的酵素MAPキナーゼの変化を介し、異形成、低形成腎を来すという仮説をin vivoおよびin vitroの実験系を用い検証した。胎生60日で尿路閉塞術を行ったヒツジ胎仔腎は多嚢胞性異形成腎となる。嚢胞上皮において増殖、アポトーシスの亢進、線維化の指標であるTGF-βの発現増加と共にMAPキナーゼの異常(p38、活性型ERK増加、JNK減弱)がみられた。そこで尿路閉塞の流体力学的変化を尿管芽細胞周期的伸展によりin vitroで再現し、MAPキナーゼの病的意義を検討した。p38、ERKは伸展により活性化された。増殖、TGF-β発現も伸展により増加しp38、ERK阻害により抑制された。アポトーシスは増殖より遅れて増加し、p38、ERK阻害、抗TGF-β抗体により抑制された。したがってp38、ERKがTGF-β発現、増殖、アポトーシスを介し胎生期尿路閉塞による異形成腎発症に関与する可能性が考えられた。また分化した腎尿細管細胞であるIMCD細胞をJNK阻害剤存在下で培養することにより、JNKが増殖充進、アポトーシス抑制、E-cadherin発現誘導、TGF-β発現抑制を介し尿細管細胞のbranching、分化・形質維持に関与することが明らかになった。つまりJNKの発現低下も嚢胞上皮の未分化状態と関係すると考えられる。一方、胎生早期(50日)に尿路閉塞したヒツジ胎仔腎は低形成になる。胎生50日、60日閉塞腎を経時的に比較することにより、嚢胞拡大による後腎間葉細胞増殖抑制が低形成腎の原因となる可能性が示唆された。最後に、ERKの病的意義を多発性嚢胞腎のモデルpcyマウスを用い検討した。ERK阻害により腎腫大、嚢胞形成が抑制され、血圧、血清クレアチニン値は有意に低値、尿浸透圧は高値であった。以上よりERK阻害による治療の可能性が示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 300千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】14208087 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / 血管新生 / ES細胞 / BMP / 骨芽細胞 / シグナル伝達 / 受容体 / 細胞分化 / 血管内皮細胞 / 平滑筋細胞

【研究成果の概要】

1)マウスのES細胞はFlk-1陽性の血管前駆細胞に分化したあと、VEGFの作用の有無により、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞に分化する。血管内皮細胞と平滑筋細胞が共存する条件では潜在型TGF-βが効率良く活性化されることが知られている。この系においてTGF-βレセプターキナーゼの抑制剤であるSB-431542を添加したところ、血管内皮細胞の増殖とシート形成が著明に促進されることが明らかとなった。血管内皮細胞ではタイトジャンクションの形成に関わるclaudin-5の産生がSB-431542によって著明に上昇し、細胞と細胞の境界に集積している像が観察された。
2)我々は、マウス間葉系前駆細胞C2C12とヒト間葉系幹細胞をBMP4で骨芽細胞へ分化誘導する系において、BMP4が内因性のTGF-βの作用を活性化してSmad6の発現を誘導し、その結果、Smad6がBMP4による骨芽細胞分化を抑制することを見いだした。SB431542は内因性のTGF-βの作用を抑制し、Smad6の発現を抑制した結果、骨芽細胞分化をBMP4と協調的に促進した。この結果は、TGF-βシグナルを制御することによってBMPシグナルを増強する可能性を示唆し、骨・軟骨再生医療に応用できると考えられた。
3)我々はヒト微小血管内皮細胞(HMEC)とES細胞由来血管内皮細胞に対してBMP4がその増殖を強く促進し、アポトーシスを抑制することを明らかにした。BMP4の標的遺伝子を解析した結果、BMP4はId-1やVEGFR2、Tie-2の発現を亢進させ、さらにこれらの受容体のリン酸化を促進することが明らかとなり、BMP4による血管内皮細胞増殖促進作用はVEGF-A/VEGFR2とAngiopoietin-1/Tie-2シグナル伝達系を介していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2005

【配分額】53,170千円 (直接経費: 40,900千円、間接経費: 12,270千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】11480215 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / DNAマイクロアレイ / 浸潤 / 受容体 / Smad / 血管内皮細胞 / 転写調節 / 細胞分化 / 骨形成因子 / 骨芽細胞 / シグナル伝達 / 表皮角化細胞 / 血管新生

【研究成果の概要】

1.BMPによるC2C12細胞の骨芽細胞への分化にSmadがどのように関わっていくかを、アデノウィルスベクターによる発現系を用いて検討した。BMP処理を行った細胞で、ALP活性の上昇が認められるが、Smad1及びSmad5を過剰発現された細胞ではその活性が更に増強された。抑制型Smadを過剰発現させた細胞では、逆にALP活性の低下が認められた。C2C12細胞の骨芽細胞様分化誘導におけるBMP-4とBMP-6のシグナル経路を解析した。BMP-4は主にALK-3に結合してSmad1/5/8を活性化するのに対し、BMP-6はALK-2に結合しSmad1/5を活性化した。また、BMP-4とBMP-6の両者を加えることにより、いずれか一方よりも強力な分化誘導作用が見られた。
2.血管内皮細胞ではTGF-βのI型受容体であるALK-5に加えてALK-1が発現しており,それぞれが異なるR-Smadを活性化する。血管内皮細胞におけるTGF-βの標的遺伝子を明らかにする目的で,ヒト臍帯静脈血管内皮細胞に活性型のALK-1とALK-5をアデノウイルスベクターを用いて導入し,オリゴヌクレオチドマイクロアレイを行った。その結果、約7000の遺伝子の中からALK-1ではSTAT1、endoglin、Idファミリーの転写因子、Smad6、Smad7などが特異的に誘導されることがわかった。一方、ALK-5ではclaudin5の抑制が見られ、tight junctionの形成がALK-5で影響を受けることが考えられた。ヒト臍帯静脈血管内皮細胞にALK-5を導入すると細胞の増殖抑制が見られ、一方ALK-1を導入するとin vitroでの細胞分化促進が見られたことから、DNAチップで得られた遺伝子が血管内皮細胞の増殖・分化に関与していることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】11557015 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / シグナル伝達 / 蛋白質間相互作用 / マススペクトロメトリー / Smad / DNAP / 骨形成因子 / 構造決定 / 質量分析 / アミノ酸配列

【研究成果の概要】

蛋白質-蛋白質間の相互作用による細胞内シグナル伝達機構を明らかにするためにSmadに結合する蛋白質をマススペクトロメトリーで同定することを目的として実験を行った。Smad1〜8にFla-tagをつけたコントラクトを作り哺乳類細胞にトランスフェクションした。ついでアガロースピーズに結合した蛋白質をFlag抗体を用いて免疫沈降し、共沈する蛋白質を銀染色したSDS-PAGEから切りだし、トリプシン処理したのち、マススペクトロメトリーによってペプチドの質量を測定した。その結果、Rabファミリーのタンパク質がSmad1と結合することが明らかとなった。
Smad3はCAGAというモチーフに活性化された時にのみ結合することから、CAGA sequenceを用いてDNA affinity purification (DNAP)によるSmad3の回収を試みた。その結果、HaCaT細胞ではSmad3はTGF-βによって活性化されたときにのみ特異的にCAGA sequenceに結合し、さらにSmad2も共沈することが確認された。また転写共役因子であるp300やc-SkiがSmad3とともに回収できることが確認された。
結合タンパク質の特異的な回収のためにはPoly d(1-C)の濃度の決定、ビーヅの洗浄の条件、DNAとの反応時間の設定などが重要であることが確認された。またダイナビーヅを用いることによって、タンパク質を銀染色で調べた場合、劇的にバックグラウンドが低くなることが明らかとなった。以上からDNAPを用いることによって細胞内に存在するSmad結合タンパク質を活性化された時に特異的に効率良く回収できることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】12,700千円 (直接経費: 12,700千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09480199 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / 骨形成因子 / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / 遺伝子ターゲッテイング / レセプター / アクチビン / アポトーシス

【研究成果の概要】

1. Tkv結合蛋白質クローニングとその哺乳類細胞での機能解析:ショウジョウバエのセリン-スレオニンキナーゼ型レセプターであるThick veins(Tkv)に結合する蛋白質をtwo-hybrid法で検索し、DIAP1(Drosophila apoptosis inhibitor-1)をクローニングした。
2. Smadのシグナル伝達機構における役割:我々はSmadファミリーの分子をその構造と働きから、特異型、共有型、抑制型の3種類に分類できることを明らかにした。また新しいSmad分子であるSmad6をクローニングした。Smad6は他のSmadの作用を抑制する抑制型Smadであることが明らかとなった。
3. 骨形成因子のシグナル伝達におけるSmadの役割と遺伝子導入による解析:アデノウイルスベクターに組み込んだSmad1やSmad5を骨芽細胞前駆細胞に導入してその作用を調べた。Smad1やSmad5は単独で細胞に感染させても骨芽細胞への分化誘導活性は低いが、低濃度のBMPや活性化型レセプターを加えると、作用の劇的な増強が見られた。
4. TGF-βシグナルに関与するSmad3の変異体の機能解析と腫瘍形成能:Smad3の407番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異を作り、その作用を検討した。変異型Smad3はTGF-βのシグナルを伝達しないだけでなく、優勢抑制型変異体として作用した。変異型Smad3を大量に発現している細胞ではTGF-βの増殖抑制作用に対し抵抗性になっていた。さらにこれらの細胞をコラーゲンゲルの上で3次元培養するとコラーゲンゲルの中に細胞が浸潤していく像が見られた。
5. シグナル伝達分子の遺伝子ターゲッテイング:BMPレセプターII型遺伝子およびSmad2のターゲッテイングを行った。いずれも発生初期の段階で致死的であった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】15,100千円 (直接経費: 15,100千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】09470042 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DPC4 / TGF-β / 標的遺伝子 / one-hybrid / サブトラクション / 細胞周期 / DPC-4, / TGF-b, / TAK1, / TAB-1, / 増殖制御、 / 細胞周期、 / シグナル伝達、 / 転写制御

【研究成果の概要】

DPC4(SMAD4)はSAMD2あるいはSMAD3と複合体を形成し、TGF-β標的遺伝子のプロモーター領域に直接結合することで、標的遺伝子の発現を制御する。そこで、DNAと直接相互作用するDPC4をbaitに用いたyeast one-hybrid法を行うことでDPC4の標的遺伝子の探索を行った(one-hybrid法はbaitタンパク質と特異的に相互作用するDNA断片を単離する方法)。約2×10^5種類のヒトゲノム由来DNA断片をスクリーニングした結果、3種類のDNA断片を得た。One-hybrid法で得られたDNA断片内にはDPC4が認識するコンセンサス配列が実際に含まれており、本方法が標的遺伝子の探索に有効な方法のひとつであることが確認された。塩基配列決定後のデータベース検索により、1つがヒト28SrRNA遺伝子と一致することがわかった。残る2つのDNA断片については、目下解析中である。DPC4標的遺伝子の探索の別のアプローチとして、サブトラクション法及びプロモーター・トラップ法によるスクリーニングも進めており、現在、細胞周期・シグナル伝達・細胞骨格関連の遺伝子群と新規遺伝子群に焦点を定めた解析を行っている。さらに、DPC4による細胞周期制御機構を明らかにする目的でDPC4に特異的に結合する新規蛋白質の探索も昨年度に引き続き行っている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】13,200千円 (直接経費: 13,200千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】08458233 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / アクチビン / 骨形成因子 / レセプター / シグナル伝達 / セリン・スレオニンキナーゼ / 血管新生 / 皮膚角化細胞 / セリン-スレオニン・キナーゼ

【研究成果の概要】

1.GDF-5のレセブターの同定:我々はBMPファミリーに属する新しい因子GDF-5(growth/differentiation factor-5)のレセブターとの結合と機能解析を行った。GDF-5は2種類のBMPのI型レセプター(BMPR-IAとBMPR-IB)のうちBMPR-IBにのみ特異的に高い親和性で結合することが明らかになり、他のBMPファミリーとの特性の違いが明らかとなった。
2.GDF-5の血管新生作用:我々はBMP-2やGDF-5の血管新生作用を検討し、TGF-βやアクチピンと比較した。その結果、in vivoのアッセイ(CAMアッセイやウサギの角膜アッセイ)でGDF-5に血管新生作用があることが確認されたが、BMP-2には血管新生作用はなかった。血管新生のメカニズムを明らかにするためにウシ大動脈由来の培養血管内皮細胞に対するGDF-5の作用を調べた結果、内皮細胞の遊走やプラスミノーゲンアクチベータの産生を促進することが明らかになり、血管新生のメカニズムが明らかとなった。
3.皮膚におけるアクチピンの分化誘導作用:皮膚におけるアクチピンの細胞増殖・分化への作用を調べる目的で、ヒト皮膚組織の免疫組織化学的検討と培養角化細胞におけるその機能の検討を行った。正常ヒト皮膚組織や培養角化細胞HaCaTにおいてIB型レセブター(ActR-IB)、II型レセブターの発現が見られた。アクチピンAは培養角化細胞に作用し分化誘導作用を示したが増殖抑制作用は軽度であった。これに対しTGF-βは増殖を強く抑制するが、分化は誘導しなかった。シグナル伝達分子Smad2やSmad3のリン酸化にアクチピンとTGF-βで明らかな違いが見られ、アクチピンではSmad3により特異的な活性化が見られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996

【配分額】6,300千円 (直接経費: 6,300千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】08457495 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / TGF-βスーパーファミリー / GDF / BMP / セリン / スレオニンキナーゼ型受容体 / シグナル伝達 / アポトーシス

【研究成果の概要】

TGF-βスーパーファミリー遺伝子群は、個体発生ならびに癌化との関わりが、最近特に注目されている。しかしながら、30種類近くあるTGF-βスーパーファミリーリガンドとTGF-βスーパーファミリー受容体の間では、必ずしも1対1の相対関係が成立せず、複数のリガンドが異なる親和性をもって受容体を共有していることが知られている。このことは、TGF-βスーパーファミリーの多様な作用のメカニズムを解明する上で重要なポイントと考えられ、われわれは、本研究において、TGF-βスーパーファミリーにおけるリガンド受容体の明確な対応関係を明らかにすることならびにシグナル伝達経路を解明することを大きな目的として研究を行った結果、以下に示す成果を得た。1)新規セリン/スレオニンキナーゼ型受容体ならびに種々のタイプII受容体を、様々な組み合わせでCOS細胞に共発現させ、TGF-βスーパーファミリーリガンドとの結合能を、親和性架橋結合法ならびに非標識リガンドを用いた定量的結合検定法にて解析することにより、新たにBMPファミリーに属するGDF-5の受容体を同定した。2)TGF-βtype I受容体細胞内領域に変異導入を行うことにより、TGF-βの増殖抑制シグナルとマトリックス誘導シグナル伝達経路を分離しえた。3)BMPにより特異的に発現が誘導される遺伝子を同定するために未分化間葉系細胞を用い、differential display法を行なった結果、新規シグナル伝達分子、BORG(BMP/OP-responsive gene)のクローニングに至った。4)新規セリン/スレオニンキナーゼ、ASK1の解析を進めた結果、ASKIが、TNFや、様々なストレスによって誘導されるアポトーシスのシグナル伝達分子のひとつであることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996

【配分額】6,300千円 (直接経費: 6,300千円)

【研究分野】病体医化学

【研究領域課題番号】07557334 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / アポトーシス / セリン-スレオニン・キナーゼ / アクチビン / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)は細胞の増殖を抑制するほか多彩な作用をもった生理活性物質である。TGF-βは二種類のセリン-スレオニンキナーゼ型レセプター(I型、II型)によってシグナルを伝達し、細胞内ではSmadという蛋白質を介してシグナルを伝達する。本研究では以下のプロジェクトについて研究を行った。
1)TGF-βI、II型レセプターの種々の疾患における発現:網膜芽細胞腫や扁平上皮癌、前立腺癌などを中心にレセプターの発現と変異の有無を検討した。網膜芽細胞腫の培養細胞株ではII型レセプターの発現を認めないが、分化にともない発現が見られた。II型レセプターのプロモーター領域には変異は見られなかった。またI型レセプターにも異常があることが示唆されたが、Smadには異常は見られなかった。前立腺癌でもI、II型レセプターの発現の低下を認めた。
2)TGF-βレセプターの細胞内基質の同定とcDNAクローニング:酵母を用いたtwohybrid法により、ショウジョウバエのI型レセプターThick veinsの基質となるペプチドしてDIAP1(Drosophila inhibitor of apoptosis-1)をクローニングした。
3)シグナル伝達分子Smadの作用と疾患における異常の検討:TGF-βレセプターのシグナル伝達分子Smad2の異常を同定するため、遺伝子構造の決定を行った。さらにSmad2にはエクソン3が転写されないタイプのものが存在することを明かにした。エクソン3のないSmad2はこれをもつものよりも活性が高い可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】07457032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / リン酸化 / シグナル伝達 / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / 増殖抑制 / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

1. β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)のII型レセプターによるI型レセプターの活性化
TGF-βはまずII型レセプターに結合し、この結果I型レセプターをリン酸化して活性化するが、そのさいI型レセプターのGSドメインとよばれる構造が重要であることがこれまでに知られている。今回我々は、I型レセプターの膜貫通領域とGSドメインの間に位置する領域(以下、JM領域)のシグナル伝達における重要性を明らかにした。さらにII型レセプターとI型レセプターのリン酸化部位の同定を試み、II型レセプターでは膜貫通領域とキナーゼ活性領域の間に位置する領域とC末端領域が、またI型レセプターではJM領域とGS領域のセリンやスレオニンがリン酸化されることを確認した。今後はリン酸化によってどのようなシグナルが伝えられるかを明らかにする。
2. TGF-βI型レセプターの細胞内基質の同定とシグナル伝達機構
我々は酵母を用いたtwo-hybrid法によってTGF-βI型レセプターの基質となるペプチドのクローニングを試みた。その結果FKBP12(免疫抑制剤であるFK506やラパマイシンの細胞内結合ペプチド)やfarnesyl transferase-αを見出した。さらに最近ショウジョウバエ由来のI型レセプターであるthick veinsやsaxophoneに結合するタンパク質の同定をtwo-hybrid法で試みた。その結果、FKBP-12の他、少なくとも3つの新しいタンパク質が結合することが明らかとなった。今後はこれらのタンパク質のシグナル伝達における役割、とくに増殖抑制やアポトーシスへの効果を検索する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1995

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)