Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

整形外科学 / 変形性関節症 / 再生医療学 / 軟骨再生 / 再生医学 / iPS細胞 / 軟骨細胞 / 再生医療

iPS細胞は量的な制約がなく、再生医療の魅力的なツールである。本研究では化合物を用いてヒトiPS細胞から軟骨細胞を分化誘導する方法の開発に取り組み、わずか二種類の化合物を用いて一週間前後で良好な軟骨細胞を誘導することに成功した。本方法ではサイトカインを使用しないため、非常に均質な分化をもたらすことができるのが特徴で、フローサイトメトリーによる解析でも分化し損ねた細胞は全く検知されなかった。またこの方法で誘導した細胞をマウスの膝に移植したところ、良好な軟骨を形成した。

変形性関節症 / 軟骨代謝学 / 軟骨細胞 / 再生医療

Hif2a+/-マウスでは変形性関節症は著明に抑制されたが、タモキシフェン誘導性軟骨特異的ノックアウトマウス（Col2a1-CreERT2;Hif2a-f/f）でも類似した結果が得られた。反対にCol2a1-CreERT2;Hif1a-f/fでは著明に関節軟骨の変性が促進され、HIF1AとHIF2Aの関節軟骨における作用が反対であることが明らかとなった。更なる解析によって、HIF1Aは軟骨破壊に関与するタンパク分解酵素の発現を抑制することも明らかとなった。

骨 / 軟骨代謝学 / 軟骨細胞 / インジケーター / iPS細胞 / 幹細胞 / 再生医療

Col2a1,Prx1などのプロモーターを用いた蛍光レポーターiPS細胞を樹立し、レチノイン酸やBMPなどを用いた分化誘導法にて蛍光発色し、かつ軟骨マーカーを高発現することを確認した。この細胞を用いて様々な誘導因子の検討を行い、BMPのほか、インスリン、TGF-beta、Notchシグナル阻害剤、Wntシグナル阻害剤でも強力に蛍光発色することを見出した。現在はそれらの最適な組み合わせについて検討している。

シグナル伝達 / 再生医療 / 軟骨細胞

ヒトX型コラーゲンプロモーター領域の解析(プロモーターレポーターアッセイ、ゲルシフトアッセイ、クロマチン免疫沈降)により前年度までに転写開始点より80塩基上流に転写因子Runx2の結合領域(HY-box)を同定した。この領域はRunx2を導入しなくてもある程度の転写活性の上昇がみられるため、様々な因子に応答するuniversal enhancerと考えられた。そこで、この領域を4回タンデムにつないだ配列を蛍光レポーターベクター(Ds-red)に組み込んだコンストラクトをマウス軟骨細胞由来細胞株であるATDC5に安定導入し、肥大分化すると蛍光を発する細胞の作製に成功した。この細胞は実際にRunx2を導入することで、インスリン誘導下の培養にてより早く蛍光を発することが確認された。今後は、次年度に申請中の挑戦的萌芽研究「変形性脊椎症・関節症治療を目指した軟骨細胞肥大分化モニタリング法の確立と応用」の計画の如く、cDNAライブラリーソースを用いたレトロウイルス発現ライブラリーをこの細胞に導入して、肥大分化にかかわる新規分子のスクリーニングを行う予定である。さらに、新規分子の遺伝子改変マウスを作出して、新規因子の肥大分化に関わる機能をinvivoにも証明することを検討している。

ナノテクノロジー / 再生医療 / 軟骨細胞 / ハイドロゲル / 液性因子 / 三次元培養 / 増殖 / 分化

軟骨は運動・支持組織の主要な構成組織であり、外傷、加齢性疾患などの様々な疾患により障害をうける軟骨の再生、再建は、整形外科学のみならず現代医学の最重要課題の一つとなっている。軟骨再生医療は徐々に成果を挙げつつあるも、広範に軟骨が欠如している変形性関節症や、顎顔面先天異常などの他科疾患に広く応用するためには、in vitroで、3次元構造を有する再生軟骨を作る必要がある。一方、近年、必要な分子組成あるいは分子構造を人工的に合成し、高機能高分子化合物を創製するナノ分子技術が飛躍的な発展を遂げている。本研究では、ナノ分子技術を応用し、患者由来の軟骨細胞をin vitroで大量増殖させ、3次元形態を有する再生軟骨を作製することを目的として、ナノ分子技術を応用した増殖および分化培養法の確立、ならびに再生軟骨の機能化と性能評価を行った。
培養中に生じる軟骨細胞の脱分化現象を防止するためには3次元培養が有効である。しかし、軟骨細胞の3次元大量培養法は報告例がない。本研究では、ナノファイバーである中空糸を導入し、3次元大量培養装置の開発を試み、その基盤技術を確立した。また、軟骨細胞増殖培養に伴って生じる細胞の脱分化という問題に対処すべく、脱分化型軟骨細胞を再分化させるための液性因子の組み合わせを網羅的に検索したところ、BMP-2とinsulin、甲状腺ホルモン(T3)の組合せ(BIT)が理想的な再分化誘導法であることを見出した。軟骨細胞の増殖・分化に必要な足場素材に関しても、感染の危険性のない新規合成ペプチドの使用を検討した。さらに、遺伝子導入に使用する機能化ナノミセル構造体に関しても、検討を進め、軟骨再生への応用を試みた。いずれも、近年急速に進歩したナノ分子技術の成果をいち早く再生医学に導入し、医工の融合により、実現が望まれている軟骨再生を試み、大きな成果を得た。

【研究分担者】
門野夕峰	東京大学	医学部附属病院	准教授	(Kakenデータベース)
矢野文子	東京大学	医学部附属病院	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
緒方直史	東京大学	医学部附属病院	講師	(Kakenデータベース)
森崎裕	東京大学	医学部附属病院	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
鄭雄一	東京大学	大学院・工学系研究科	教授	(Kakenデータベース)
中山修一	東京大学	医学部・附属病院	医員	(Kakenデータベース)
原慶宏	東京大学	医学部・附属病院	助教	(Kakenデータベース)
村上元昭	東京大学	医学部附属病院	医員	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
位高啓史	東京大学	大学院医学系研究科	研究拠点特任教員	(Kakenデータベース)
川口浩	東京大学	医学部附属病院	助教授	(Kakenデータベース)
中村耕三	東京大学	医学部附属病院	教授	(Kakenデータベース)
小笠原徹	東京大学	医学部附属病院	寄付講座教員	(Kakenデータベース)
鄭雄一	東京大学	医学部附属病院	寄付講座教員	(Kakenデータベース)