【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】15K14366 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / マウスES細胞 / ノックイン / CRISPR/Casシステム / 遺伝子組換えマウス / ES細胞 / 点変異

【研究成果の概要】

新たなゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムは、簡便かつ高効率に遺伝子改変動物を作製することができる。本課題では、単純な遺伝子破壊ではなく、点変異やノックインなどのより高度なゲノム編集を試みた。
まず、受精卵注入法で試みたところ、0.1kb以下のノックインは効率良く導入できたが、それ以上のノックインはうまくいかなかった。つまり、受精卵注入法でのノックイン効率は、導入カセットの大きさに依存して低下することが分かった。次に、相同組換え効率が高いマウスES細胞を用いたところ、一本鎖オリゴDNAよりも二本鎖DNAの方がはるかに効率良く、そして両アリルへ目的変異を導入できた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】26640056 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CRISPR/Cas / 実験動物 / ノックアウト / 点変異 / ノックイン / 不妊

【研究成果の概要】

エネルギー産生などに重要な細胞内小器官であるミトコンドリアには、細胞核と独立したゲノムDNAが含まれる。また、ミトコンドリアDNAに変異があると、様々な病態を引き起こすことが知られている。今回、我々は最新の標的遺伝子組換え技術であるCRISPR/CAS9システムを活用することで、ミトコンドリアDNA (mtDNA) の標的遺伝子組換え技術を開発することを試みた。ES細胞でのミトコンドリア遺伝子破壊を試みたが、残念ながら、標的遺伝子が破壊された細胞株を得ることができなかった。今後は、ES細胞を用いて処理数を増やすと同時に、ミトコンドリア移行効率を上げるなどの、戦略変更の必要があると結論した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2015-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】25250014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム編集 / 生殖不全 / 遺伝子破壊 / 点変異 / ES細胞 / ノックイン / CRISPR/Cas9 / 男性避妊薬 / CRISPR/Cas / 実験動物 / ノックアウト / 不妊 / 人工制限酵素 / 遺伝子組換え

【研究成果の概要】

本研究課題では、ZFNやTALENに代わる新しい遺伝子改変技術であるCRISPR/Cas9システムを用いてマウス個体レベルでのゲノム編集技術を確立した。まずpCAG-EGxxFPプラスミドを作製し、EGFP蛍光を指標に培養細胞内でのDNA切断効率を判定する系を確立した。次に、標的配列を認識するgRNAとDNA切断するCAS9酵素を発現するプラスミドを受精卵に注入し、両者を一過性に発現させることで、約半数の子孫で遺伝子破壊マウスを作製できる系を確立した。さらにゲノム編集したES細胞を用いたキメラ解析などが実用的であることを示した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】45,890千円 (直接経費: 35,300千円、間接経費: 10,590千円)