【研究領域課題番号】19K22954 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

椎間板 / 力学刺激 / 線維輪 / BioMEMS / 生体模倣デバイス / Pax1 / 硬節 / 再生医療 / メカニカルストレス / 伸展刺激 / エンハンサー / MEMS / ３次元培養 / マイクロ流体デバイス

【研究成果の概要】

生体内における椎間板組織の変形を模倣するため、円形培養チャンバーの中央部に髄核を模倣した伸縮性のバルーンを設置し、培養ゲル組織の円周方向に力学刺激を負荷可能な伸展培養デバイスを作製した。同デバイスにおいて特定のECMを用いて線維輪細胞のゲル内培養を行うことで、自己組織化が顕著に促進されリング状の椎間板様培養組織を構築することに成功した。また、繊維輪細胞は、伸展刺激により線維性組織分化が亢進し、軟骨性組織分化が抑制されることを見出した。本研究を通じて、3次元椎間板組織構築のための基盤となるデバイス開発および組織の力学刺激応答性に関する知見を得ることができた。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2019-06-28 - 2022-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究分野】生体医工学・生体材料学

【研究領域課題番号】15K16319 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞ファイバー / 三次元培養 / 移植 / 再生医療 / 再プログラム化 / 再生医工学 / 細胞ファイバ

【研究成果の概要】

マイクロ流体デバイスを用いて形成されるコアシェル型細胞ファイバーを細胞培養・移植一体型デバイスとして応用することを目的に、ファイバー内での細胞培養と細胞特性評価、および細胞ファイバーの移植技術の研究を実施した。
アルギン酸ゲルをシェルとし、コアのファイバー状空間内でヒト線維芽細胞およびiPS細胞の新規三次元培養系を確立した。その三次元空間内における細胞周辺環境を最適化することで、特に線維芽細胞においては若返り(rejuvenation)が可能であることを示した。さらに、細胞ファイバーを特定の分化誘導培地で培養することで、ファイバー内で細胞運命制御が可能であることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】生体医工学・生体材料学

【研究領域課題番号】26560222 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

毛髪再生 / 生体組織工学 / 三次元培養 / 共培養 / 再生医療 / 再生医療工学 / コラーゲンゲル / 毛包 / 生体外再生 / 毛包再生 / マイクロインジェクション / 多層ビーズ

【研究成果の概要】

本研究課題では細胞の空間的配置を制御することで生体外で毛髪再生を実現することにを目的としている．そこで毛包構造を再現するために，2種の細胞が多層構造を成すコラーゲンゲル培養法の開発を実施した．
具体的には，マウスES細胞を毛乳頭細胞の代替源として第1細胞層とし，その上層をマウス表皮細胞層で覆うコラーゲンゲルビーズの作製法を開発した．同技術を用いて作製した多層ゲルビーズを生体外で培養したところ，毛包構造およびその周辺組織である立毛筋の再構築を認めた．
以上，新たに構築した多層ゲルビーズ培養法を用いることでこれまでに実現し得なかった生体外プロセス単独での毛包構造の再生を実現した．

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】24592719 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞凝集塊 / 非接着培養 / 間葉系細胞 / 線維芽細胞 / 毛包誘導 / 幹細胞 / 免疫組織学的検討 / 遺伝子学的検討 / 再生医療 / 未分化 / 三次元培養 / 未分化性

【研究成果の概要】

C57BL/6Jマウス新生仔の皮膚より間葉系細胞を採取・培養したのち、非接着性培養皿で無血清培地を用いて細胞凝集塊を形成した。凝集塊は比較的長期に生存可能であり、その間いわゆる冬眠状態である可能性が示唆された。また細胞凝集塊の性質について遺伝子学的、免疫組織学的検討を行ったところ、凝集塊形成により毛包誘導や毛周期に関わりの深いWnt関連因子や、細胞の未分化性を示すSox-2、Oct-4、CD133、cxcr4などの遺伝子発現が相対的上昇することが判明したが、これら因子の分布は必ずしも凝集塊内で均一でなく、一部の細胞の性質が変化した結果なのか、もしくは細胞の選択が行われたのかは今後要検討である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】胸部外科学

【研究領域課題番号】17790958 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

無細胞化大動脈弁 / 拍動循環バイオリアクター / 心臓弁再生 / 組織工学 / 石灰化 / バイオリアクター / 拍動 / 三次元培養 / 血管再生 / 再生医療

【研究成果の概要】

本研究の最終年度である2007年度は,これまで開発してきた無細胞化大動脈弁を大動物に移植して左心高圧系に耐えうる再生心臓弁の可能性を実証する実験を行った.具体的には,マイクロ波と拍動循環とデオキシコール酸を使った独自処理方法を駆使し,清潔に採取したブタ大動脈弁を無細胞化してブタ下行大動脈に移植する実験を行った.移植期間は3ケ月(n=4),6ケ月(n=3),12ケ月(n=3)の3群に分け,組織学的また力学的に検証した.その結果,無細胞化大動脈は,1例も狭窄や瘤化するなどの問題は起こらず,1年間の長期にわたって高圧部位で機能することが明らかとなった.移植後の弁葉のカルシウム濃度を調べたところ,無細胞化大動脈弁は臨床で使われている最も優れた抗石灰化処理が施されている生体弁の1つであるプリマステントレス弁と比較しても顕著に石灰化を抑制できることが明らかとなった.無細胞化大動脈弁では,3ケ月,6ケ月,1年と長期使用しても弁葉部のカルシウム濃度は同程度であり,かつ,移植時の体重約40kgから半年後には3倍以上の体重に成長しているにもかかわらずカルシウム濃度は増大しないことが明らかとなった.したがって,本組織無細胞化心臓弁は成長する低年齢層に使用しても石灰化の抑制という点で大きな効果があると考えられた.また,弁葉の力学的特性を調べたところ,移植前と移植後3ケ月で弁葉の破断強度及び破断ひずみは同程度であり,強度は保持されることが判明した.また,乳下静脈から採取・培養した血管内皮細胞を培養して無細胞化した大動脈弁に予め拍動バイオリアクターを使って播種する手法も確立でき,6ケ月の移植実験から内皮細胞を播種しておいた方が再生が早く起こることが示唆された.以上より,本技術で開発した無細胞化心臓弁は左心高圧系でしっかり機能し,かつ再生し石灰化も抑制できることが明らかとなった.

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16390431 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ナノテクノロジー / 再生医療 / 軟骨細胞 / ハイドロゲル / 液性因子 / 三次元培養 / 増殖 / 分化

【研究成果の概要】

軟骨は運動・支持組織の主要な構成組織であり、外傷、加齢性疾患などの様々な疾患により障害をうける軟骨の再生、再建は、整形外科学のみならず現代医学の最重要課題の一つとなっている。軟骨再生医療は徐々に成果を挙げつつあるも、広範に軟骨が欠如している変形性関節症や、顎顔面先天異常などの他科疾患に広く応用するためには、in vitroで、3次元構造を有する再生軟骨を作る必要がある。一方、近年、必要な分子組成あるいは分子構造を人工的に合成し、高機能高分子化合物を創製するナノ分子技術が飛躍的な発展を遂げている。本研究では、ナノ分子技術を応用し、患者由来の軟骨細胞をin vitroで大量増殖させ、3次元形態を有する再生軟骨を作製することを目的として、ナノ分子技術を応用した増殖および分化培養法の確立、ならびに再生軟骨の機能化と性能評価を行った。
培養中に生じる軟骨細胞の脱分化現象を防止するためには3次元培養が有効である。しかし、軟骨細胞の3次元大量培養法は報告例がない。本研究では、ナノファイバーである中空糸を導入し、3次元大量培養装置の開発を試み、その基盤技術を確立した。また、軟骨細胞増殖培養に伴って生じる細胞の脱分化という問題に対処すべく、脱分化型軟骨細胞を再分化させるための液性因子の組み合わせを網羅的に検索したところ、BMP-2とinsulin、甲状腺ホルモン(T3)の組合せ(BIT)が理想的な再分化誘導法であることを見出した。軟骨細胞の増殖・分化に必要な足場素材に関しても、感染の危険性のない新規合成ペプチドの使用を検討した。さらに、遺伝子導入に使用する機能化ナノミセル構造体に関しても、検討を進め、軟骨再生への応用を試みた。いずれも、近年急速に進歩したナノ分子技術の成果をいち早く再生医学に導入し、医工の融合により、実現が望まれている軟骨再生を試み、大きな成果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】14,400千円 (直接経費: 14,400千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】15592098 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生軟骨 / 液性因子 / 脱分化 / 顎関節 / 統計的手法 / Cdk6 / CGKII / 細胞分化 / CGK II / 軟骨 / 三次元培養 / 再生医療

【研究成果の概要】

顎関節の再生医療は口腔外科分野における最重要課題のひとつである。本研究では、近い将来での臨床応用を目的として、顎関節領域における軟骨再生のための基礎的研究を行った。内容は(1)再生軟骨組織作成のための基礎的研究、ならびに(2)骨軟骨細胞の分化制御メカニズムの解明とに大別される。(1)については、使用する細胞として、鼻中隔軟骨細胞と耳介軟骨細胞とを選択した。それは、口腔外科の主要な対象疾患である口唇口蓋裂をはじめとする先天奇形に対する手術の際に入手可能であることや、間葉系幹細胞を効率良く軟骨細胞に分化させることが現時点では困難なため、早期の臨床応用には軟骨細胞による再生を目指す方がより現実的である、等の理由による。まず、(1)安全性の面からFBSは用いない、(2)軟骨細胞の特性を維持した状態で1000倍以上の増殖を獲得する、(3)すでに臨床応用実績のある増殖因子を使用する、という三つの基準をもって、増殖因子の組み合わせの最適化を図り、FGF-2、insulinあるいはIGF-Iの組み合わせが最適であることを明らかとした。ついで、脱分化型軟骨細胞を再分化させるための液性因子の組み合わせを網羅的に検索し、BMP-2とinsulin、甲状腺ホルモンの組合せが理想的であることを見出した。また、いくつかのハイドロゲルについて、軟骨再生における足場素材としての特性を検討した。なお、上記の実験で用いた細胞は、顎顔面領域における先天異常の手術に伴い、廃棄される予定だった軟骨細胞を患者の同意に基づき使用させていただいた。また、(2)については、分子細胞生物学的手法により、CGKIIが軟骨分化に重要な機能を有すること、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞の分化においてCdk6が分化抑制因子として重要であることなどを報告し、骨軟骨再生医療の発展に不可欠な骨軟骨細胞の分化増殖メカニズムの解明を行った。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)