【研究領域課題番号】21H02817 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経再生 / 脊髄損傷 / 神経回路 / 細胞外環境 / シナプス / 再生医療 / 細胞外マトリックス / 脊髄損傷・中枢神経障害 / AI機能解析

【研究成果の概要】

中枢神経系損傷に対する治療展開およびその基盤となる基礎研究を目指し、再生阻害因子CS（コンドロイチン硫酸）の除去による再生環境整備と人工シナプスコネクターを用いた積極的な神経の人為接続という２つの異なる新しい再生医療へのコンセプトを融合し、「超回復モデルの作成と検証」「超回復を活かしてのAIモーションキャプチャーによる機能改善過程の解析」「脊髄損傷時における痛覚感覚受容解析とその再生」の3点を推進する。再生阻害因子の制御ではCS発現抑制のための核酸医薬の導入（Nature Commun.）を、シナプスコネクターは我々の国際共同研究によって作成及び実証された新規人工合成キメラタンパク質CPTX（Science　2019）を応用するものである。本年度はおもに下記の2点を中心に推進した。
１）既存の脊髄損傷モデルの生理的回復と修復を遥かに凌駕する超回復モデルの作製
中枢神経系損傷に対して、阻害因子であるCSの発現を核酸医薬で抑制し「再生環境整備」とともにと人工的シナプスコネクターCPTXによる「シナプスの人為的積極的結合」を統合を進め、超回復モデルの作成を進めている。相加相乗的な効果を期待するものであるが、CPTXの機能が細胞外基質であるCSの発現量で制御されるという想定外の画期的な結果を得ることが出来た。２）超機能回復への“AIモーションキャプチャー（キネマトレース）解析”の導入と確立　　統合による超回復モデルと、それぞれの回復性と特性の違いを活かしつつ、客観的かつ定量的な運動機能回復評価が可能な「AI機械学習を利用したモーションキャプチャー」システムを構築している。それぞれの機能回復マウスにおいて特徴的な運動機能改善の要素を抽出することに成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】16,900千円 (直接経費: 13,000千円、間接経費: 3,900千円)

【研究領域課題番号】19H03124 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬 / 脊髄損傷 / 再生医療 / メカニカルストレス / 骨髄脂肪細胞周囲細胞 / 血管新生因子 / 間葉系幹細胞 / トレッドミルトレーニング / 脊髄再生医療 / リハビリテーション

【研究成果の概要】

犬の骨髄脂肪細胞周囲細胞（BM-PACs)にシアストレスが加わることで、血管内皮増殖因子（VEGF）の発現上昇が起こることを明らかにし、BM-PACsを用いた脊髄再生医療において、運動療法は移植されたBM-PACsにシアストレスを与え、血管新生作用を強化することで組織再生や機能改善の促進が期待された。実際に脊髄損傷による歩行困難を呈した犬に対し、BM-PACsの経静脈投与とリハビリテーションを組み合わせた治療の臨床試験を行ったところ、1例のみであったが、BM-PACs投与後、後肢随意運動の回復がみられ、さらにリハビリテーションを介入させることで、歩行可能なレベルへの改善がみられた。

【研究の社会的意義】

近年、自発的な回復が期待できない脊髄損傷に対し、さまざまな幹細胞を用いた再生医療の開発が医療および獣医療で進めらており、実際に臨床応用も行われるようになっている。本研究は、そのような再生医療が発展し、適応されるようになってもなお、リハビリテーションが重要な治療法でありうることを示し、また、再生医療によりもたらされる治療効果を相加的に向上させうる可能性を示すものである。メカニズムについては十分な検討には至らなかったが、再生医療において細胞の機能性を高める因子として、リハビリテーション（運動療法）により発生しうるメカニカルストレスという新たな概念を提唱しうるものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究領域課題番号】19H03123 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬 / 間葉系幹細胞 / 脊髄損傷 / 再生医療 / 骨髄脂肪細胞周囲細胞（BM-PAC) / 病期分類

【研究成果の概要】

急性期脊髄損傷を対象とした実験では、他家移植による治療効果を検討した。免疫不全マウス脊髄損傷モデルに犬BM-PACを投与した場合と比較し、正常な免疫を持つマウスに犬BM-PACを移植した場合は、治療効果が低減した。また、ビーグル皮下に他家BM-PACを移植したところ、T細胞やマクロファージの浸潤がみられた一方で、自己細胞の場合は、それらの細胞の浸潤はみられなかった。これらのことから、間葉系幹細胞であるBM-PACはホストからの免疫を受けており、他家移植は自家移植と比較し、移植効果を得ることが難しいと考えられた。他家移植は急性期症例に対する迅速な治療法として期待できるが、免疫抑制剤などとの併用が必要であることが示唆された。
一方、慢性期脊髄損傷を対象とする実験では、これまで、BM-PACから神経細胞様の形態と遺伝子発現特性を有する細胞の誘導に成功しており、本年度はさらに、誘導後の細胞が神経組織を構築する能力を有するかどうかを検証するため、ニューロスフェアへの誘導を行い、３次元培養により構築された組織の神経組織としての性状を評価した。その結果、平面培養と比較して、３次元培養を行なった場合は、未分化マーカーであるSOX2やOCT4の発現上昇がみられ、近年、ヒト神経幹細胞マーカーとして提唱されているMusashi1の発現上昇も確認され、3次元培養ではより未分化な神経幹細胞様細胞がニューロスフェア内に誘導されると考えられた。ニューロスフェアは培養を継続すると成熟神経細胞マーカーの発現もみられるようになり、BM-PACから神経幹細胞様細胞を含むニューロスフェアを形成可能と考えられた。また、一部のスフェアにはTyrosine HydroxylaseやChATの発現が上昇しており、誘導されたニューロスフェアから、特定の機能を有するニューロンへ分化誘導が可能であることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】16,640千円 (直接経費: 12,800千円、間接経費: 3,840千円)

【研究分野】獣医学

【研究領域課題番号】16H05037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬 / 脊髄再生医療 / 間葉系幹細胞 / 脊髄損傷 / 再生医療 / 肝細胞成長因子 / 静脈投与 / 生体内イメージング / 骨髄間葉系幹細胞 / In vivo イメージング

【研究成果の概要】

新規犬間葉系幹細胞を用いた犬の脊髄再生医療の開発を目指し、急性期および亜急性期脊髄損傷モデルに対するBM-PAC移植の治療効果をBM-PACからの液性因子分泌に着目して評価・解析した。急性期および亜急性期脊髄損傷に対しBM-PACを静脈内投与したところ、BM-PACは損傷部位へHomingした。また、急性期では肝細胞成長因子（HGF）、亜急性期では血管内皮細胞増殖因子（VEGF）などの液性因子の分泌を開始、組織損傷抑制・保護効果あるいは組織再生効果を発揮することで、運動機能回復の促進に寄与することが示唆された。本研究から、BM-PACの静脈内投与による犬の脊髄再生医療の臨床応用が期待できる。

【研究の社会的意義】

犬では脊髄損傷が多く、重症例では術後の歩行回復が十分ではなく、動物のみならず飼主のQOLも著しく低下する。近年、これらの症例に対するMSCを用いた脊髄再生医療が導入されるようになっているが、科科学的根拠に不足し、MSC移植の効果に期待した盲目的な投与が多くなっている。本研究は、独自に見出した新規MSCであるBM-PACを用い、脊髄再生医療に利用できる性質を有していること、また、動物モデルを用いた有効性・安全性試験を通し、移植法の妥当性、運動機能回復効果が得られるメカニズムについて明らかにし、科学的根拠に基づいた犬の脊髄再生医療を開発に貢献した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】24592210 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経幹細胞 / ES細胞 / 脊髄損傷 / マーモセット / 霊長類 / 再生医療

【研究成果の概要】

コモンマーモセットES/iPS細胞由来神経幹細胞を用いた、コモンマーモセット症例モデルへの移植は、霊長類における多能性細胞を用いた再生医療の前臨床研究として有用である。そこで我々が樹立したコモンマーモセットES細胞から胚葉体(Embryoid Body; EB)形成を介して神経幹細胞へと分化誘導する方法の開発を行った。その結果、本方法で得られたニューロスフェアは自己増殖能を持ち、一次ニューロスフェアからは主にニューロンが、二次ニューロスフェアからは、ニューロンに加えてアストロサイトが生み出されることが明らかとなった。これは、中枢神経系の発生において、まずニューロンが産生され、遅れてグリア細胞が産生される現象を、in vitroで再現しているものと考えられる。さらに培養方法を改良することで、オリゴデンドロサイトへの分化誘導も可能となった。本方法で得られた神経幹細胞から生み出されたニューロンは、Ca imagingにより、機能的である可能性が示唆された。また、マイクロアレイにより神経分化の過程における遺伝子発現プロファイルを調べ、主成分解析を行ったところ、ES細胞からの分化過程において、遺伝子発現プロファイルが徐々に胎児由来神経幹細胞に近づいて行くことが示された。本方法で得られた神経幹細胞をマウスの脳に移植したところ、移植細胞がニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトへ分化していることが確認された。
これらの結果より、コモンマーモセットES細胞から、in vitroで神経発生をある程度再現しながら、胎児由来神経幹細胞に近い性質を持つ神経幹細胞へと誘導することができたと考えられる。現在、本研究により得られたコモンマーモセットES細胞由来神経幹細胞を、コモンマーモセット脊髄損傷モデルへ同種間移植することにより、詳細に移植の有効性、特に安全性を評価している。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2013-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】22791404 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脊椎脊髄病学 / ES/iPS細胞 / コモンマーモセット / 脊髄損傷 / 再生医療

【研究成果の概要】

本研究では、コモンマーモセットES細胞から神経幹細胞へと効率良く分化誘導する方法を確立した。得られた神経幹細胞は自己増殖能を持ち、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生み出すことが可能であった。また、ES細胞から分化誘導に伴い、遺伝子発現プロファイルが胎児由来ニューロスフェアに近づいていることが示された。従って、マーモセットES細胞から、in vitroで神経発生をある程度再現しながら、胎児由来ニューロスフェアに近い性質を持つニューロスフェアへと分化誘導することができたと考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】22791398 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脊髄損傷 / シュワン細胞 / 再生医療 / 脱分化 / 再分化 / 髄鞘化 / 神経堤細胞

【研究成果の概要】

本研究では、神経堤由来の細胞を標識できるトランスジェニックマウスに脊髄損傷モデルを作成することにより、損傷脊髄内におけるシュワン細胞の動態を経時的に評価した。末梢神経の損傷において、シュワン細胞が脱分化/再分化する現象はWaller変性の過程として認識されているが、中枢神経損傷におけるシュワン細胞の可塑性を評価した報告はない。損傷脊髄におけるシュワン細胞の動態を詳細に把握することにより、生体が本来備えている修復機構を明らかにし、中枢神経系の再生医療に結びつけることが本研究の目的である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】21390426 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脊髄損傷 / 人工多能性幹細胞 / 移植 / 再生医療 / 細胞移植 / コモンマーモセット

【研究成果の概要】

マウス脊髄損傷に対するマウス及びヒトiPS細胞由来神経幹細胞(iPSC-NS/PC)移植を行い、移植前にin vitroで安全なクローンを選別すれば、移植後に腫瘍形成はみられず、運動機能回復を促進することが明らかになった。さらに前臨床研究の最終段階として、サル脊髄損傷に対するヒトiPSC-NS/PC移植を行い、その安全性および有効性を確認した。安全性の評価を事前に十分行えば、ヒトiPSC-NS/PCは脊髄損傷に対する細胞移植療法における細胞供給源として有用である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】16,770千円 (直接経費: 12,900千円、間接経費: 3,870千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】20791054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医療 / 脊髄損傷 / 細胞移植 / 神経堤幹細胞 / 霊長類 / 神経堤 / 後根神経節 / 皮膚 / 骨髄 / 胚葉転換

【研究成果の概要】

神経堤幹細胞は成体の皮膚や骨髄から回収でき、また神経細胞へ分化するため、損傷脊髄に対する移植細胞の供給源として期待される。本研究では、マウス脊髄損傷モデルに神経堤幹細胞を移植したところ、移植細胞は損傷脊髄内で生着し、神経細胞へ分化することが明らかになった。また移植細胞は腫瘍化せず、神経堤幹細胞移植の安全性も確認された。さらに霊長類であるサルや人からも神経堤幹細胞の回収に成功した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)