【研究分野】スポーツ科学

【研究領域課題番号】23500779 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ガス状伝達物質 / 一酸化炭素 / 硫化水素 / ヘムオキシゲナーゼ / パルスオキシメータ / カーボライザー / 呼気ガス / 一酸化窒素 / カルボキシヘモグロビン / heme oxygenase / 運動 / トレーニング

【研究成果の概要】

本研究では、ガス状伝達物質として注目されている一酸化炭素に着目し、運動時における一酸化炭素呼気排出量を計測するとともに、血中の一酸化炭素含量を定量化するための測定法の開発、さらにはマウスを用いて運動・トレーニングによる筋組織におけるヘムオキシゲナーゼ活性の変化について検証することを目的とした。呼気一酸化炭素排出量は、ランプ負荷運動中直線的に増大し、運動終了後速やかに回復することが明らかになった。また、多波長の光源を複合的に用いることにより経皮的に一酸化炭素ヘモグロビン濃度を計測する装置の開発と基礎実験を完了した。さらに、一過性走運動によりマウス腓腹筋のヘムオキシゲナーゼ活性の上昇を確認した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】麻酔・蘇生学

【研究領域課題番号】14370495 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

敗血症 / 輸血 / 微小循環 / ヘモグロビン / 腸管壁防御機構 / 一酸化窒素 / 一酸化炭素 / 内毒素血症 / ヘムオキシゲナーゼ

【研究成果の概要】

本研究では「輸血によるヘム負荷がストレス応答酵素ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)が誘導されるような侵襲下においては過負荷となり、生体防御機構のバランスを崩す」という仮説を基に、平成14年から3年間に渡り研究を行った。正常ラットに比べ、亢進している内毒素血症ラットの腸管壁透過性は、輸血による高ヘモグロビンでさらに増強することを見出した。そこで、ストレス応答酵素HO-1をヘミン投与により予め誘導したラットを用いて検討したが、輸血ならびに血液希釈ラットを含め交換輸血後、16時間以内に全例が死亡した。死亡前のラット腸管壁におけるHO-1誘導を免疫染色したところ、少なくとも腸管粘膜へのHO-1表出は顕著ではなく、その関与が否定的となった。さらに、HO-1誘導時に同時産生されるビリルビン値は高ならびに低ヘモグロビンラット共に測定限界以下で、HO-1過剰誘導を示さなかったことから、高ヘモグロビンによる内毒素惹起性腸管壁透過性の増強は、HO-1誘導に起因するものではないといえる。さらに生体顕微鏡下により腸管粘膜微小循環を観察したところ、正常ヘモグロビンラットに比べ、高ヘモグロビンは毛細血管密度を含め微小循環を阻害する}方、低ヘモグロビンはほぼ正常に近い赤血球速度を含め微小循環ならびに毛細血管蜜度を維持した。さらに高ヘモグロビンでは、内毒素血症ラットで認める血流停止と再開を繰り返す現象をさらに増強した。一方、低ヘモグロビンラットは変化をきたさなかった。また一酸化窒素(NO)ドナーを表面灌流したところ、微小循環血流は改善し、NO合成酵素(NOS)阻害薬L-NAMEによりNOを抑制したラットにおいては、腸管粘膜微小循環血流はいずれの群においても著しく阻害された。これらの所見より、腸管粘膜におけるNOS誘導が高ヘモグロビンで高まる免疫染色所見と一致し、NOが高ヘモグロビンによる内毒素惹起性腸管壁透過性亢進に関与していることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】12,000千円 (直接経費: 12,000千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】14370063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヘムオキシゲナーゼ / 一酸化炭素 / 可溶性グアニル酸シクラーゼ / 一酸化窒素 / 遺伝子改変動物 / シスタチオニンベータシンターゼ / シスタチオニン合成酵素 / 硫化水素 / アミノ酸置換体 / ノックアウト動物 / heme oxygenase / cystathionine β synthase / 胆汁分泌 / microcirculation / heme oxgenase / carbon monoxide / nitric oxide / hypoxia / soluble guanylate cyclase / conditional knock out mice / cystathionine beta synthase

【研究成果の概要】

ヘムを一酸化炭素(CO)、鉄およびビリベルジンに分解するヘムオキシゲナーゼ(HO)は多彩な生物活性を有していることが知られているが、HOアイソザイム固有の生理活性の発現とその調節機構、COにより制御される標的分子の検索、さらに生体内で産生される他のガス分子との相互作用について未だその全貌が解明されていない。本研究課題では、HOアイソザイム発現とCOなどの反応生成物を介した生物作用発現との関係を明確に議論できる実験系を確立し、本酵素活性の生体制御における病態生理学的意義について解析することを目的としてきた。この目的遂行のために、既に報告のあるHO遺伝子欠損で認められる繁殖不全を回避できるOre-LoxPシステムに基づいた新しいコンディショナルノックアウトマウスの作成に着手し、現在までに目的とした相同組換えを起こしたES細胞を用いてキメラマウスの作成に至っている。次に、COにより特異的に作動する新規細胞内レセプタの検索を行うために、COにより惹起される細胞内代謝変動をCE-MSを用いて解析した。その結果、アセトアミノフェン投与による肝臓内CO産生増加に伴い、肝臓内メチオニンの増加とS-アデノシルメチオニンおよびシステインからグルタチオンやタウリンに至る代謝経路の抑制が認められた。この結果より、メチオニンからシステイン合成に至る含硫アミノ酸代謝経路に存在するcystathionine β-synthase(CBS)がCOの新しい細胞内標的分子であることが明らかになってきた。また、CBS精製蛋白を用いてCOによる酵素活性阻害様式を解析した結果、数mMのCOによりCBS活性阻害が認められるがこれはヘムの2つの軸配位子のうちシステイン残基がCOと置換することで生じることが明らかになった。さらに我々はCOと別の内因性ガス状メディエータである一酸化窒素(NO)と生体内における相互作用について解析した結果、網膜組織内において両者の既知標的分子である可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)活性を局所で産生されるCOとNOが協調して制御しており、このCOによるsGCの活性制御は局所のNO濃度に強く依存していることが明らかになった。本研究期間でHO-CO系を介した新たな生物活性を見出すことが出来たが、今後我々が取り組んでいる新規遺伝子改変動物の利用により更なるHOの生物学的意義の解明を行う必要があると考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】11,200千円 (直接経費: 11,200千円)

【研究分野】麻酔・蘇生学

【研究領域課題番号】13557132 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

heme oxygenase / Oxygen carrier / Hemoglobin / microcirculation / nitric oxide / bilirubin / carbon monoxide / Kupffer cells / NO / CO / 微小循環 / ヘモグロビン / バイオイメージング / ビリルビン / hme oxygenase / リポソーム / 一酸化炭素 / 酸素 / ヘムオキシゲナーゼ / シトクロームP450 / 肝臓

【研究成果の概要】

肝臓・網内系は修飾ヘモグロビン(Hb)の主要な代謝コンパートメントである。ショック病態で救急救命に使用できる酸素運搬体はこれらの病態においても肝臓の恒常性を維持しつつ循環動態を改善できるスペックを持つ必要がある。本研究ではショック病態の肝臓ではヘムの分解代謝の動態が劇的に変動し、通常では考えられないような速度で肝臓に取り込まれたヘムがbilirubinに変換されることを明らかにした。これはストレス応答によりヘム分解酵素であるheme oxygenase (HO)-1が肝臓実質とKupffer cellで誘導されるためである。このような状況で肝臓に大量のHbが負荷されると肝臓の血流と胆汁を維持しているCOが捕捉、消去されてしまうため、血流低下や胆汁低下を来たすことが明らかになった。ヘモグロビン(Hb)を径250ミクロン大のliposomeに封入、表面をpolyethylene glycolで修飾して、血小板活性化能のない新規脂質で安定化させた試料を投与すると、そのような急速なヘムの分解や分解系酵素の誘導が抑制され、肝臓の血流や胆汁分泌が維持された。またビリルビンの表面修飾によりNOによるHbのメト化も部分的に抑制された。本研究ではHb-based oxygen carrierを体内投与した際に生じうる血管内皮細胞の機能変動をin vivoで評価する系としてNOのbioimaging技術を確立し、腸間膜における血管内皮細胞由来のNOのリソースについて重要な知見を得た。これまでNOのリソースは血管内皮と神経系と考えられてきたが、我々の得た知見は赤血球から供給されるリソースの存在を示唆するものであった。このような知見からHbを修飾した酸素運搬体ではこのような血流代償作用が期待できないことが示唆され、リポソーム型の場合であっても、血管内空間でリサイクルされるNOにどの程度の影響を与えるのかをさらに詳細に解析していく必要があると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】09470143 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

heme oxygenase / 一酸化炭素 / 一酸化窒素 / cytochrome P450 / 伊東細胞 / guanylate cyclase / カルシウム / 肝細胞 / ヘムオキシゲナーゼ / 微小循環 / 血管内皮細胞 / ヘモグロビン

【研究成果の概要】

我々は肝臓で内因性に生成される一酸化炭素(CO)が類洞血管抵抗を生理的レベルに低く保つために必要不可欠である内因性血管弛緩因子であることをラットを用いた実験的研究で世界で初めて明らかにした。この結果を基盤として本研究の平成9、10年度ではCOが肝臓における胆汁酸依存性胆汁輸送の内因性抑制物質であることを明らかにすると同時に、そのメカニズムとして同じガス状物質であるNOのようにミトコンドリアの呼吸鎖の抑制には直接関係せず、胆汁分泌系の起始部である毛細胆管の律動的収縮運動に対する抑制効果が関与すること、その場合COのレセプター分子としてcytochrome P450 epoxygenaseが関与し、細胞内カルシウムの動員抑制が抑制効果の本態であることを明らかにした。この結果はCOの新しい情報伝達系が提示された意義とともに、従来情報伝達系と考えられてきたsoluble guanylate cyclaseを介さない経路が存在することを示唆している点で極めて重要な成績である。一方COの生成酵素であるheme oxygenaseのアイソザイム(HO-1,HO-2)の肝臓における分布は全く明らかにされていなかったが、前者が、類洞内に分布するKupffer cellに、後者が類洞外の肝実質細胞に分布することが新規に作成した単クローン抗体による免疫組織学的検討で明らかにされ、類洞外空間(HO-2)で生成されたCOが血管周皮細胞である伊東細胞を弛緩させて血管抵抗が恒常的に低く保たれることが示された。本酵素のアイソザイムが臓器内の特定の細胞群に特異的に発現していること、それらの生理学的意義が明らかにされたのも初めてのことである。今後、HO-1の転写活性を上昇させる刺激として、低酸素、活性酸素、サイト力インなどの役割に着目し、これらの侵襲因子が上昇することが知られている小児外科領域でのtotal parenteral nutrition使用後のcholestasisや高血圧動物モデルにおける血管トーヌス異常におけるHO反応の役割をさらに検討する予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】5,100千円 (直接経費: 5,100千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】06454264 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

一酸化炭素 / 一酸化窒素 / ヘムオキシゲナーゼ / 微小循環 / 伊東細胞 / 肝臓 / 胆汁うっ滞 / ビリルビン / heme oxygenase / 一酸化窒素ラジカル / cGMP / 肝類洞循環

【研究成果の概要】

新年度末に明らかになった内因性一酸化炭素(CO)による肝血管抵抗の調節作用を示す成績から、COの作用部位の特定を明らかにするため、肝実質細胞,類洞内皮細胞,伊東細胞を初代培養し、CO,NOによるcyclic GMPの反応を検討した。その結果、伊東細胞は可溶性グアニレートシクラーゼ活性が極めて高く、CO数μMに反応してcGMPが上昇することが示された。一方分離灌流肝を用いた系において、COの生成酵素であるヘムオキシゲナーゼの阻害剤を投与すると肝血管抵抗が上昇するのに伴い、類洞血管の不連続性狭小化が起こること,狭小化部位に一致して伊東細胞が局在することが明らかとなった。以上のことから、類洞のトーヌスが肝実質から生成されたCOが伊東細胞に作用し、cGMP依存性に調節されることが示された。肝実質細胞のCOはそれ自身に作用し、何らかの生物活性を発揮する可能性が考えられるが、ヘムオキシゲナーゼが胆汁色素の代謝のkey Enzymeであることを考慮し、COが胆汁流量の調節因子である可能性の検証を試みた。ラット分離灌流肝において、ヘムオキシゲナーゼ阻害剤Zinc protoporphyrin IXの投与により胆汁流量は灌流液中に胆汁酸が存在するときに有意な増加を示した。また肝細胞における胆汁排泄のmotivation forceとなる毛細胆管の収縮間隔を、培養肝細胞のtime-lapse video microscopy で解析したところCOの抑制により収縮回数の増加が認められた。しかしながらこの現象にはcGMPの関与は否定的であり、一方、細胞内ATP量がヘムオキシゲナーゼの阻害により上昇することから、現在COが細胞内ATPを変動させ、K^+チャネルの機能を変化させる可能性を検討している。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】7,200千円 (直接経費: 7,200千円)