【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】17300135 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオイメージング / 胎盤特異的遺伝子導入 / レンチウイルス / 着床 / 合胞体栄養膜細胞 / 融合 / syncytin / レンチウィルス / GFP / 精子 / 卵子 / 受精 / 胎盤 / 遺伝子導入 / 蛍光たんぱく質 / 子宮 / 輸卵管

【研究成果の概要】

近年の遺伝子工学技術の目覚ましい進歩に伴い、胎盤への遺伝子導入に関しても種々の検討が行われている。代表的な例として、ウイルスベクターを用いた胎盤や子宮内腔への局所投与、胎盤特異的なプロモーターの利用などが挙げられるが、胎盤組織に対するダメージが大きく、遺伝子発現の強さや特異性が十分でないといった問題点があり、現時点では満足のいく技術の開発には至っていなかった。本研究では「透明帯を除去した胚盤胞にレンチウイスルベクターを感染させる」という極めて簡便な方法で、胚にダメージを与えることなく、また胚への遺伝子導入を全く起こすことなく胎盤特異的に遺伝子を導入することができることを示し、胎盤イメージングの手法に革新的な方法を確立することに成功した。また胎盤のイメージング技術の基礎を確立することができたことにとどまらずその応用にも着手し、この技術が特定の遺伝子の胎盤における機能解析に使用できることを示すためにEtsなど欠如により胎盤の機能が不全となり、それが原因で流産または胚性致死となるノックアウトマウスを材料として取り上げ、それらKOマウスの胎盤に対して特異的に欠如している遺伝子を導入して胎児をレスキューし、生後における解析ができることを示した。このことは個体レベルでの遺伝子機能研究の発展に貢献できることを示したばかりではなく、胎盤のイメージングを目指した本研究の成果は「胎盤の遺伝子治療」への道を開いたものと考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】15,950千円 (直接経費: 14,600千円、間接経費: 1,350千円)

【研究分野】蚕糸・昆虫利用学

【研究領域課題番号】12306003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カイコ / ESTデータベース / 平均化ライブラリー / 神経ホルモン / ジーンターゲッティング / フェロモン / バキュロウイルス / 遺伝子導入 / GFP

【研究成果の概要】

神経ホルモンPBANにより制御されるカイコガ性フェロモン産生系をモデルとして、ホルモンによる昆虫機能発現の分子機構解析を試みた。まず、カイコ純系系統p50フェロモン腺の平均化cDNAライブラリーより構築したフェロモン腺ESTデータベースから浮き彫りにしたフェロモン腺特異的遺伝子の解析を行った。その結果、フェロモン生合成酵素であり、かつ、フェロモン成分の種特異性を規定するキー酵素でもある不飽和化酵素(Desat1)およびアシル基還元酵素(pgFAR)の性質を明らかとし、これら酵素の基質特異性がフェロモン成分の厳密な成分割合の決定に重要な役割を担っていることを示した。これらの成果の一部は米国科学アカデミー紀要(PNAS,2003年8月5日号)に掲載され、その表紙を飾った。また、PBAN受容体遺伝子のクローニングに成功し、これがロドプシン受容体ファミリータイプのGPCRであることを示すとともに、昆虫培養細胞での機能発現を行い、その基本的性質を明らかにした。さらに、メス成虫の血リンパより、フェロモン腺特異的遺伝子pgACBPの転写を活性化する因子を単離し、その構造をβ-グルコシル-O-チロシンであることを明らかにした。
一方、機能発現に関わる昆虫遺伝子の機能を包括的に解析するツールとして、カイコでのジーンターゲッティング法の開発に向けた方法論の確立を試み、Golicらによって開発された相同組み換えによるジーンターゲティング法のカイコへの適用を行った。現在、この手法の実施に必要なFLP部位特異的リコンビナーゼとI-SceIエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入したトランスジェニックカイコの作成と、標的配列に相同なDNAから成るドナーコンストラクトの構築を進めているが、この最新の形質転換技術をカイコでの系に応用することはノックアウトカイコの作製を可能とするものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2003

【配分額】47,600千円 (直接経費: 40,100千円、間接経費: 7,500千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】11358015 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子組み換ええミニブタ / 共焦点レーザ顕微鏡 / 遺伝子導入 / Micro porous glass / micro manipulator / Enhanced green fluorescent protein / 遺伝子組みえ替えミニブタ / 三次元視硬性内視鏡 / ミニブタ卵胞卵 / レーザ共焦点顕微鏡 / 水浸型対物レンズ / 遺伝子組み換えミニブタ / 培養卵保持MPGマイクロポケット / 低侵襲採卵 / GFP(green fluorescent protein)

【研究成果の概要】

トランスジェニック(Tg)ミニブタ作製技術は細胞・組織・臓器移植のための異種移植ドナー作出等、様々な分野に極めて大きなインパクトをもたらす。しかし、Tgブタ作製効率は大変低く、多大の時間、労力と経費を要する。食肉センター由来の卵巣資源を用いた体外受精により、遺伝子導入に必要不可欠な前核期受精卵を安定供給でき、Tg胚をあらかじめ移植前に選抜し、母体へ戻すことができれば効率的である。本研究では、Tgブタ作製高効率化を目的として、まず、ブタ体外成熟・体外受精卵作出における卵巣採取個体の性成熟の影響と体外受精前核への遺伝子注入時期検討し、次いで、移植前選抜レポーターとしてのEnhanced green fluorescent protein(EGFP)の有用性をコンストラクトの異なる3種のEGFP遺伝子を前核期体外受精卵へ顕微注入、その後の体外発生およびEGFP発現状況に及ぼす影響を調べた。また培養システムとしてMPG(micro porous glass)のマイクロポケットに循環する流れに乗せて固定しレーザ共焦点顕微鏡下で培養し、培養過程で卵の2次元画像や、3次元形状を連続的に観察可能とした。さらに、体外受精卵前核への遺伝子注入操作における装置の自動化についても検討した。その結果、1)開発した乱培養装置にて培養が可能であること、2)性成熟雌ブタ由来卵子を用いることにより効率的な体外受精卵生産ができること、3)体外受精後12時間での前核形成初期においても遺伝子注入操作が可能であること、4)EGFP遺伝子の導入効率はプロモーターの種類と注入DNAの断片長に影響されこと、5)胚選抜のマーカー遺伝子としてのEGFP遺伝子の利用は、ブタ胚では4細胞期胚や胚盤胞が適していること、および6)顕微鏡下における遺伝子注入操作装置の自動化はTgブタ胚作製の高度化に有効であることが判明した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】29,000千円 (直接経費: 29,000千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】11878160 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゼブラフィッシュ / 視物質 / オプシン / 色覚 / GFP / 発現制御 / プロモーター / 遺伝子導入

【研究成果の概要】

マウスは2種類の錐体視物質を同一の錐体細胞で発現していることが明らかとなり、新規視物質遺伝子の導入による色覚高次化機構の解明には適さないことが明らかになった。そこで対象をゼブラフィッシュのみに絞ることとした。ゼブラフィッシュの桿体視物質遺伝子についてgreen fluorescent protein(GFP)レポーター遺伝子を用いてプロモーター解析をおこなった。桿体視物質遺伝子については隣接上流DNA領域4.2、2.5、1kbを用いてGFP発現誘導能を調べた。各発現コンストラクトをゼブラフィッシュの受精卵にマイクロインジェクションし、それぞれ50%以上の個体で網膜にGFPの発現を確認した。さらに10-30%の個体では脳、おそらく松果体にGFP発現を観察した。4.2kbの上流域コンストラクトを導入した個体約100匹のうち1匹は次世代に発現コンストラクトを伝達した。このことはF1でのゲノムDNAに対するPCR及びサザンハイブリダイゼーションにより実証した。その個体をfounderとしてF1及びF2を飼育し、GFPの発現が眼球特異的であることをウェスタンブロッティング及びGFP発光観察により確認し、さらに網膜の桿体視細胞特異的であることをGFP発光観察により立証した。さらにGFP発現誘導開始時期は桿体視物質遺伝子発現と同じ受精後48時間であり、開始場所は網膜腹側の同一箇所であることも確認した。これらから桿体視物質遺伝子のプロモーター領域が遺伝子上流4.2kb内にあることが明らかとなった。インジェクションをおこなった個体にみられた松果体での発現誘導はトランスジェニックラインでは観察されなかった。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】08877117 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子導入 / Green Fluorescent Protein / 膜電位依存性カリウムチャネル / ラット心筋梗塞モデル / HOJリポゾーム / 不整脈モデル / HVJ-リポゾーム

【研究成果の概要】

平成10年度はラット心筋梗塞モデルを作製しHVJウィルスを用いた遺伝子導入法の作製ならびにイオンチャネルの制御機構を解析した。
実験計画 本年度はHVJ-リポソーム法を用いてGreen Fluorescent Protein(GFP)の発現ベクターを遺伝子導入し、蛍光活性をレーザー共焦点顕微鏡にて解析した。2)ラット慢性心筋梗塞モデルを用い非梗塞部心筋における膜電位依存性Kチャネルの発現量を検討した。
結果1) GFP発現ベクターを遺伝子導入することにより心筋細胞内に遺伝子導入することが可能であることが組織レベルで明らかとなった。2)心房、心室で各KvlmRNAの存在を認めた。Kv1.2は心室ではsham群とMI群で有意な変化を認めなかったが、心房ではMI群で減少した。Kv1.4は心房、心室でham群とMI群で有意な変化を認めなかった。一方、Kv1.5は心房ではsham群とMI群で有意な変化を認めなかったが、心室ではMI群で著明に減少した。さらにアンギオテンシン変換酵素阻害薬を投与し心筋リモデリングを退縮させることによりKv1.2とKv1.5の発現量の変化は抑制された。
まとめ GFP発現ベクターを遺伝子導入することにより心筋細胞内への遺伝子導入が可能である事が組織レベルで明らかとなった。また心房と心室ではKv1.2とKv1.5の発現制御が異なっており、これらのチャネル発現量の変化は心筋梗塞後リモデリングに伴う電気生埋学的変化に関与している可能性が示唆された。
(Shibata K et.al.Modification of K channel mRNA Expression in Postinfarction Remodeled Ventricular Myocardium Circ Res.1999,in submission)

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】1,600千円 (直接経費: 1,600千円)