【研究分野】動物生理・代謝

【研究領域課題番号】09440276 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ホヤ / ニシン / ナメクジウオ / ヒト / 精子活性化物質 / 精子走化性 / カルシウム・ナトリウム交換反応 / 高速度ビデオ解析 / ユウレイボヤ / 精子運動活性化 / ステロイド物質 / カルモジュリン / 高速度ビデオカメラ / 精子運動開始 / store-operated Caチャネル / 単一イオンチャネル / ダイニン軽鎖 / 精子運動阻害物質 / 受容体 / 精子走行性 / リン酸化チロシン / イオンチャンネル / ヒト精子 / 精子培養系 / cDNAクローニング / イオンチャネル / 蛋白リン酸化 / パッチクランプ法

【研究成果の概要】

ニシン精子運動活性化についてはカルシウムイオンが2次メッセンジャーとして働いていること、cAMPは精子活性化の要因でないことが明らかとなった。更に精子活性化に伴い細胞膜の脱分極が起こること、カルシウム、ナトリウムの交換機構による細胞内カルシウム濃度の上昇が精子運動活性化に重要であることが分かり、細胞内情報伝達機構の大略が明らかとなった。ホヤでは精子活性化・誘引物質(SAAF)が2基の硫酸基を持つ新規のステロイドであるという画期的な成果を得た。現在この2種での成果を2報の論文にまとめ、それぞれをProceedings National Academy of Science, USAに投稿中である。精子走化性については、ホヤ精子で精子のとる軌跡コンピューターによって処理し、シミュレーションによって精子走化性を取り扱う数理学的研究が、さらなる精密度を求め、高速度ビデオによる軌跡解析を行うことで完成した。ヒト卵胞液由来の精子活性化物質についてはその精製が進み、それが分子量の小さな、既知のプロゲステロン、心房性利尿因子など精子を活性化することが薬理学的に知られていた物質と異なる新規物質であることが確認された。ナメクジウオでは精子に精活性化物質が結合しており、放精と同時にそれが海水中に放出され、精子を活性化することが明らかになり、最近、精製を精力的に行いほぼ精製標品を得るに至った。現在、ナメクジウオ精子活性化物質の分子機構の解明に向けて研究を行っている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 2000

【配分額】14,200千円 (直接経費: 14,200千円)

【研究分野】病体医化学

【研究領域課題番号】07557334 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / アポトーシス / セリン-スレオニン・キナーゼ / アクチビン / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)は細胞の増殖を抑制するほか多彩な作用をもった生理活性物質である。TGF-βは二種類のセリン-スレオニンキナーゼ型レセプター(I型、II型)によってシグナルを伝達し、細胞内ではSmadという蛋白質を介してシグナルを伝達する。本研究では以下のプロジェクトについて研究を行った。
1)TGF-βI、II型レセプターの種々の疾患における発現:網膜芽細胞腫や扁平上皮癌、前立腺癌などを中心にレセプターの発現と変異の有無を検討した。網膜芽細胞腫の培養細胞株ではII型レセプターの発現を認めないが、分化にともない発現が見られた。II型レセプターのプロモーター領域には変異は見られなかった。またI型レセプターにも異常があることが示唆されたが、Smadには異常は見られなかった。前立腺癌でもI、II型レセプターの発現の低下を認めた。
2)TGF-βレセプターの細胞内基質の同定とcDNAクローニング:酵母を用いたtwohybrid法により、ショウジョウバエのI型レセプターThick veinsの基質となるペプチドしてDIAP1(Drosophila inhibitor of apoptosis-1)をクローニングした。
3)シグナル伝達分子Smadの作用と疾患における異常の検討:TGF-βレセプターのシグナル伝達分子Smad2の異常を同定するため、遺伝子構造の決定を行った。さらにSmad2にはエクソン3が転写されないタイプのものが存在することを明かにした。エクソン3のないSmad2はこれをもつものよりも活性が高い可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】07457032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / リン酸化 / シグナル伝達 / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / 増殖抑制 / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

1. β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)のII型レセプターによるI型レセプターの活性化
TGF-βはまずII型レセプターに結合し、この結果I型レセプターをリン酸化して活性化するが、そのさいI型レセプターのGSドメインとよばれる構造が重要であることがこれまでに知られている。今回我々は、I型レセプターの膜貫通領域とGSドメインの間に位置する領域(以下、JM領域)のシグナル伝達における重要性を明らかにした。さらにII型レセプターとI型レセプターのリン酸化部位の同定を試み、II型レセプターでは膜貫通領域とキナーゼ活性領域の間に位置する領域とC末端領域が、またI型レセプターではJM領域とGS領域のセリンやスレオニンがリン酸化されることを確認した。今後はリン酸化によってどのようなシグナルが伝えられるかを明らかにする。
2. TGF-βI型レセプターの細胞内基質の同定とシグナル伝達機構
我々は酵母を用いたtwo-hybrid法によってTGF-βI型レセプターの基質となるペプチドのクローニングを試みた。その結果FKBP12(免疫抑制剤であるFK506やラパマイシンの細胞内結合ペプチド)やfarnesyl transferase-αを見出した。さらに最近ショウジョウバエ由来のI型レセプターであるthick veinsやsaxophoneに結合するタンパク質の同定をtwo-hybrid法で試みた。その結果、FKBP-12の他、少なくとも3つの新しいタンパク質が結合することが明らかとなった。今後はこれらのタンパク質のシグナル伝達における役割、とくに増殖抑制やアポトーシスへの効果を検索する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1995

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)

【研究分野】生物形態・構造

【研究領域課題番号】06740618 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経葉ホルモン / バソトシン / 受容体 / 無尾両生類 / cDNAクローニング / 体液浸透圧 / 体液量 / 変態

【研究成果の概要】

前年度までの研究から、下垂体神経葉ホルモンのバソトシン(VT)が、無尾両生類の体液浸透圧および体液量の調節に重要であること、また個体発生の過程においては、変態にともなう陸上への進出に重要な役割を果たすことが示唆されてきた。本研究では、無尾両生類におけるVTの役割を明らかにするため、VT受容体の発現の変動を調べることを目的として、VT受容体cDNAのクローニングを行った。
まず、哺乳類のデーターをもとに、RT-PCR法により部分的なクローンを得ることを試みた。ウシガエルとヒキガエルの腎臓および膀胱からmRNAを抽出し・精製し、cDNAを合成した。神経葉ホルモン受容体は、膜7回貫通型の受容体ファミリーに属する。その構造において、膜貫通部分やホルモン結合部位と予想される部分は、神経葉ホルモン受容体ファミリーの間で比較的保存性が高いと考えられる。そこで、これらの領域に対するdegenerateプライマーを作成し、PCRに用いた。RT-PCRを行った結果、ウシガエルとヒキガエルの両方で、水・電解質代謝の調節に関わると考えられるV-2型受容体cDNAクローンが得られた。ヒキガエルでは、もう一つの神経葉ホルモンであるメソトシンの受容体cDNAクローンも得られた。現在、cDNAライブラリーを作成し、全長の解析を行っている。ノーザン解析を行ったところ、V-2型受容体は、膀胱や腎臓といった浸透圧調節器官で特異的に発現していることがわかつた。一方、哺乳類において血圧などの調節に関わるV-1型受容体cDNAのクローン化も、肝臓のmRNAを用いて試みているが、まだ成功していない。
哺乳類以外でV-2型受容体遺伝子のクローン化に成功したのは、本研究が始めてである。今後は、得られたcDNAクローンを用い、ホルモン遺伝子の発現とともに受容体遺伝子の発現の変動を解析していく。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1994

【配分額】900千円 (直接経費: 900千円)