【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】15K14473 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖因子 / チロシンキナーゼ / 受容体 / サイトカイン / 増殖因子受容体 / シグナル伝達 / 増殖因子 / ペプチド / HGF / MET / 特殊環状ペプチド

【研究成果の概要】

細胞増殖因子受容体をダイマー化する人工リガンド技術は再生医療に応用可能であるとともに、従来にない生物活性をもつ人工リガンドを創成できる可能性が考えられる。本研究は、異なる受容体同士を人為的にダイマー化することで、ヘテロ受容体のシグナル活性化につながるかを検討した。ダイマー形成の評価系としてsplit luciferase系と原子間力顕微鏡による解析系を確立した。一方、MET受容体、RET受容体、IGF受容体についてヘテロダイマー形成を誘導したが、シグナル活性化は認められなかった。増殖因子受容体の新たな組合せを検討し、ヘテロ受容体活性化人工リガンド創成の可能性を検討することが必要と考えられた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】25221305 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 炎症 / マクロファージ / 制御性T細胞 / 組織障害 / 修復 / 脳梗塞 / 組織損傷 / 修復機構 / スカベンジャー受容体 / 転写因子 / レチノイン酸受容体 / 免疫学 / アレルギー・ぜんそく / TGFβ / 組織傷害 / T細胞 / 生体恒常性 / 細菌 / 自然免疫 / インフラマゾーム / チロシンキナーゼ

【研究成果の概要】

免疫システムは正負のシグナルがバランスを保って進行することで恒常性が維持され、この破綻がアレルギー疾患などの免疫疾患につながる。本研究はこのような免疫応答の恒常性を支えるサイトカインとそのシグナル制御の基本原理の解明し、疾患治療に応用することを目的とする。本研究では免疫を負に制御し炎症応答を収束させる3つの重要な因子を見出した。第一は核内オーファン受容体NR4aで制御性T細胞の発生維持に必要である。第二はSmad転写因子で免疫抑制因子であるTGFβの産生制御を行う。第三は修復性マクロファージで死細胞より放出される因子を処理し炎症を収束させる。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2013-05-31 - 2018-03-31

【配分額】191,880千円 (直接経費: 147,600千円、間接経費: 44,280千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】22249009 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / チロシンキナーゼ / 転写因子 / ヘルパーT細胞 / 抑制性T細胞 / TGF-β / 炎症 / 免疫応答 / 自己免疫疾患 / TGFーβ / Foxp3 / 胸腺 / TGFβ / RORgammat / インターフェロン / SOCS / アレルギー / STAT

【研究成果の概要】

サイトカインは自然免疫系の細胞や獲得免疫系の細胞を制御する。我々はサイトカインのなかで特にTGFβを中心に病原性のTh17と抑制性T細胞Tregの産生のメカニズムを明らかにした。Tregのマスター遺伝子Foxp3はSmad2,Smad3経路によって誘導され、一方Th17はSmadに依存しない経路によって誘導された。Smad非依存性の経路としてJNK-c-junによってEomesderminという遺伝子が転写抑制される経路を発見した。またサイトカインシグナルの制御因子SOCS1がTregの恒常性維持や抑制機構に必須の役割を果たすことも明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】48,750千円 (直接経費: 37,500千円、間接経費: 11,250千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】18109005 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / チロシンキナーゼ / 転写因子 / ヘルパーT / 細胞 / 樹状細胞 / Ras c-fos / ヘルパーT細胞 / インターフェロン / SOCS / 炎症 / アレルギー / 自己免疫疾患 / STAT / 負の制御 / 免疫制御 / アレルギー自己免疫疾患 / TGFβ / 抑制性T細胞

【研究成果の概要】

サイトカインはマクロファージや樹状細胞などの自然免疫系の細胞やT 細胞などの獲得免疫系の細胞を制御する。我々はサイトカインシグナルを制御するSOCSファミリーとSpred/Sproutyファミリーを中心に主に遺伝子改変マウスを用いて個体レベルでの解析を行って来た。その結果SOCS1やSOCS3は転写因子STATを制御することで、ヘルパーT細胞(Th17やTreg)の分化を調節することを見いだした。またSpred1が神経芽細胞腫の原因遺伝子であることなどを明らかにした。さらに新規のシグナル制御機構としてcAMPによるTLRシグナルの抑制にc-fosが関与することを見いだした。またSmad2/3がTGFβによる免疫抑制に必須であることも見いだした。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2006 - 2009

【配分額】107,250千円 (直接経費: 82,500千円、間接経費: 24,750千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】13680774 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / チロシンキナーゼ / アダプター / 免疫応答 / 細胞増殖 / Dok

【研究成果の概要】

チロシンキナーゼ(PTK)は細胞の高次機能に必須の情報伝達分子であり、その役割はSH2やPTBドメインを介した蛋白質間のリン酸化チロシン依存的な会合を制御することにある。申請者らが単離、同定したDokとそのファミリー蛋白質(Dok-2/-3/-4/-5)は、情報伝達の様々な局面でチロシンリン酸化され、SH2を持つシグナル分子をリクルートするドッキング蛋白質である。申請者は、多様なPTKの共通基質であるDokファミリー蛋白質について、その生理機能と癌化における機能及び作用機序の解明を目的としてDok、Dok-2二重欠損マウスの血液学的、病理学的な解析を行った。その結果、二重欠損マウスにおいて、末梢血では顆粒球、単球の増加が、骨髄、脾臓ではそれらの前駆細胞の増加が認められた。次に、その異常造血の分子機構について知る為に造血幹細胞に対する二重欠損の影響を検討したところ、顆粒球・単球系幹細胞の異常な増加と、その形成に重要なサイトカインに対する増殖応答の亢進を認めた。また、腎臓においては免疫グロブリンの沈着を伴う糸球体腎炎が認められた。さらに、bcr-ab1トランスジーンを持つ慢性骨髄性白血病モデルマウスにdok、dok-2の遺伝子欠損を導入したところ、その多くはリンパ腫を発症していた。以上の結果から、Dok及びDok-2が多様な血液細胞の増殖、機能、癌化を負に制御していることが明らかになった。一方、Dokファミリー全体の作用機構について知る為に、各分子にチロシンリン酸化依存的に会合する蛋白質を質量分析法によって同定したところ、rasGAPやNck等の既知の会合蛋白質の他に数種類の新規会合分子を見い出した。また、新規dokファミリーと考えられる全長cDNAの単離にも成功している。
これらの知見を踏まえ、現在、Dokファミリー分子の生体高次機能における役割と作用機序の解析を進めている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】12470348 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / シグナル伝達 / チロシンリン酸化 / Srcキナーゼ / ヒストンアセチル化 / レドックス / シグナル伝達経路 / 分化 / 性ステロイドホルモン / 脱落膜 / チロシンキナーゼ / c-Src

【研究成果の概要】

本研究では、子宮内膜の多様な機能発現を担う細胞内シグナル伝達経路の解明を目的として、チロシンリン酸化、ヒストンアセチル化、酸化還元(レドックス)反応について検討し、以下の点を明らかにした。
1.リン酸化:内膜分化(脱落膜化)系において、種々の蛋白のリン酸化状態が変化すると同時に、src familyチロシンキナーゼのひとつであるc-Srcが活性化していた。活性化型c-Srcを認識する抗体clone 28を用いることにより、ヒト子宮内膜及び脱落膜において、分化に伴って活性化型の発現増強を検出した。次にsrc familyチロシンキナーゼの阻害剤を用いたところ、逆説的にc-Srcは活性化し、分化も促進された。阻害剤の特異性の限界を鑑み、c-Srcの野生体および一部の変異体を発現するadenovirusを作製し、内膜細胞に感染させてその発現を確認した段階である。一方、2次元電気泳動法によりチロシンリン酸化蛋白を網羅的に解析し、分化特異的なリン酸化スポットを約20種類同定した。また、齧歯類の脱落膜化においても、活性化型の発現が増強しており、現在c-Srcノックアウトマウスの内膜分化能を検討中である。
2.ヒストンアセチル化:脱アセチル化酵素阻害剤の内膜分化への影響を検討したところ、細胞・薬剤特異的に性ステロイド依存性分化を促進した。その際、一部のコアヒストンの特定の部位がアセチル化されていた。
3.レドックス反応:内膜の増殖・分化の際、レドックス環境を調節するチオレドキシンが誘導された。分化過程では細胞外へ放出され、paracrine/autocrineに増殖を調節する可能性が示された。
内膜機能発現には、様々な蛋白修飾を通じたシグナル伝達経路の活性化が重要であることが示唆された。雌性生殖器官疾患に対して、シグナル伝達を標的にした創薬および治療開発の可能性を示唆する研究成果が得られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】16,600千円 (直接経費: 16,600千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】10878131 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JAK / STAT / CIS / エリスポエチン / インターフェロン / シグナル伝達 / チロシンキナーゼ / 細胞分化

【研究成果の概要】

我々は赤芽球様細胞ELM-1を用いてエリスロポエチン(EPO)による赤血球分化の研究を行っている。我々はEGF受容体とEPO受容体のキメラ分子を作成し、さら受容体のチロシン残基に変異を導入することで受容体細胞内ドメインの2つのチロシン残基(Y343、Y401)のいずれかが赤血球分化に必須であることを証明した。これら2つのチロシン残基はSTAT5の活性化に必要であり、STAT5と分化は密接に関連していることが考えられた。しかしながら一方IL3受容体やプロラクチン受容体とのキメラを作成して本細胞に導入したところこれらのキメラ分子はSTAT5を活性化するもののこの細胞の赤血球分化は誘導しないことを明らかにした。したがってIL3受容体になくEPO受容体に特異的な分化シグナルが存在し、STAT5とともに分化の促進に働くと考えられる。そしてそのシグナルの発生にはEPO受容体のY343、Y401のいずれかのりん酸化が必要であることが示唆される。この2つのりん酸化チロシン残基と会合する分子をクローニングするためりん酸化ペプチドによる精製を行った。アミノ酸配列決定の結果これらのペプチドにSTAT5とポスフォリパーゼCγ-2(PLC-γ-2)が会合することを明らかにした。PLC-γ-2の赤血球分化における役割を明らかにするために現在阻害剤やドミナントネガティブフォームを導入する実験を行っている。さらに酵母two-hybrid法による組織的スクリーニングを行うために、JAK2チロシンキナーゼを共発現させたスクリーニング系を開発した。これにエリスロポエチン受容体細胞ドメインをbaitとして様々なライブラリーをスクリーニングしたころフォスファチジル酸キナーゼのp55サブユニットなどが同定できた。新規分子も多数あり現在解析中である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1998

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】10557038 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / チロシンりん酸化 / インターフェロン / SH2ドメイン / シグナル伝達 / APS

【研究成果の概要】

我々は活性化型c-kitやc-fmsを用いたtwo-hybrid法によって新規チロシンキナーゼ基質のスクリーニングを行い、これまでにAPS、STAP-1,2などの新規分子をクローニングした。さらに今回SH2ドメインなどを持たない全く新しいタイプの基質WARSを単離した。本分子にはショウジョウバエでRas-MAPキナーゼ抑制系に働くことが明らかにされているある分子に類似したドメインを有する。非常に興味深いことにWARSの強制発現によってEGFによるRasの活性化が抑制された。今後各種がん細胞での発現を調べ、本遺伝子を強制発現させた場合の造腫瘍能や転位能について調べる。さらにノックアウトマウスを作成して生理機能を明らかにする予定である。
さらに酵母two-hybrid systemによってJAK2のキナーゼドメインと直接結合しそのキナーゼ活性を抑制する分子JAB(JAK-binding protein)を見い出した。JABはJAK2のチロシンキナーゼドメインに直接結合し、その活性を抑制することを見い出した。JABの生理機能を明らかにするためにJABノックアウトマウスを作成した。JABノックアウトマウスは正常に生まれてくるが生後3週間以内に全て死亡し、胸腺、脾臓の萎縮と肝臓での脂肪の蓄積および多くの組織での炎症様の単球の侵潤が見られた。これらの表現型の一部はIFNγトランスジェニックマウスに似ている。実際JAB-/-マウスとIFNγ-/-マウスとのかけあわせによって症状が全く見られなくなった。しかしそればかりでなくRag2-/-マウスとのかけあわせによっても症状は消失した。さらにJAB-/-マウスの骨髄細胞をJAK3-/-マウスに移植するとリンパ球は再構築されるもののやがてマウスは死亡した。したがってJAB-/-による個体の死はT細胞とインターフェロンγに依存することが示された。JABはT細胞においては活性化を抑え、非リンパ系細胞ではIFNγ感受性を決める分子であることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】12,300千円 (直接経費: 12,300千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】09470036 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / エリスロポエチン / 胎児造血 / エリスポエチン / エリスロポエチン受容体 / シグナル伝達 / 細胞分化 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

赤血球造血の制御機構を解明するために我々は造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子の解析を行った。まず骨髄細胞をセルソーターにて造血幹細胞を分画し、この細胞集団からPCR増幅を経てcDNAライブラリーを作成した。これを酵母two-hybrid用のベクターに組み込み、c-kitをbaitとしたスクリーニングを行った。その結果STAP-1と呼ぶ新規遺伝子をクローニングした。この遺伝子はPleckstrin homology(PH)ドメイン,Src homology 2(SH2)ドメインを有するアダプター分子でc-kitによってチロシンりん酸化された。RT-PCRの結果、STAP-1の発現はc-kitを有する骨髄細胞に限局することが明らかとなった。また最も高い発現はCD34 low/-Sca-1+c-kit+Lin-の幹細胞分面に得られた。現在生化学的な解析を行っている。
次にエリスロポエチン受容体からのシグナルを制御する分子として、我々がクローニングしたCIS3の機能解析を行った。CIS3は胎児肝臓の赤芽球前駆細胞に強く発現していた。生理機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作成した。CIS3-/-ノックアウトは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5-15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】13,400千円 (直接経費: 13,400千円)