【研究領域課題番号】21K09778 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胎仔 / 皮膚 / 再生 / 線維芽細胞

【研究成果の概要】

表皮境界部真皮線維芽細胞に発現するtwist2陽性細胞特異的にCreリコンビネースを発現するB6.129X1-Twist2tm1.1(cre)Dor/Jとactinを重合し遊走に関わる葉状仮足を形成する低分子量Ｇタンパク質であるRacをコードするexon内にlox-P siteを有し、Creレコンビナーゼを発現する細胞でRacをノックアウトすることができるSTOCK Rac1tm1Djk/Jを当研究室で交配させた。妊娠マウスに対して胎仔手術を行うので十分な数のマウスの確保が必要である。並行してICR妊娠13－15日目の妊娠マウスに胎仔手術を施し、直径１mmの円形の皮膚欠損創を作成し、actin cableの形成と細胞膜、核を3重染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。これにより真皮線維芽細胞が、actin　cableを形成して創の収縮に働くのか、あるいは細胞遊走により創傷部の閉鎖に働くのかを観察した。また、Rac-1や Rhoなどactin重合に関わる制御因子の発現を免疫染色で確認した。この結果、マウスE13の真皮組織が、actinのネットワークを形成し、全体が収縮するように閉鎖する像が観察された。本研究では、共焦点レーザー顕微鏡の3次元構築を用いて、立体的な組織でのアクチンのメッシュ構造を初めて観察することができた。これにより細胞膜を含めた3次元的な詳細な真皮の形態を撮影し、E13の真皮線維芽細胞の創閉鎖における役割、各細胞ごとのactin 重合に関わる制御因子の発現を立体的に観察した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】19H03815 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

皮膚 / 再生 / 胎仔 / アクチン / 皮膚再生

【研究成果の概要】

哺乳類の胎仔は、ある時期までの皮膚創傷は素早く、そして瘢痕を残すことなく完全に元通りに再生する。われわれは、胎生13日(E13)までのマウス胎仔の皮膚創傷は完全に再生するがE14以降の胎仔皮膚は再生せず傷跡を残すことを発見した。これまでの皮膚が完全に再生する前後の比較から、それぞれの時期に特徴的な遺伝子発現を同定した。この中からケラチン１４（CK14）とケラチン17（CK17）の発現部位でアクチン重合を制御することで、通常なら傷痕が残るマウス胎仔を、傷跡を残さず跡形なく再生させることができるか否かの検証を行った。

【研究の社会的意義】

今回の研究で、K14,K17の発現部位で、アクチンの重合を変化させても皮膚の完全再生に至ることはなかったが、表皮の遊走は完全にブロックし、これによりactin cableの形成は可能であった。皮膚の完全再生には真皮の役割も関わっているので、今後真皮の動態も同時に変化させることで、皮膚の完全再生に迫ることができるものと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】16H05494 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

皮膚 / 再生 / 胎仔 / twist2 / 再生医学 / マウス / 再生医療 / 遺伝子改変マウス

【研究成果の概要】

マウス胎生13日までの胎仔に作成した創傷は、瘢痕を残すことなく完全に再生し、胎生15日以降に作成した創傷は、肌理は再生せず、また真皮が線維化し瘢痕を残して治癒する。創傷作成後の組織切片からレーザーマイクロダイセクションとマイクロアレイを用いて詳細に発現遺伝子の比較を行い、再生を促すあるいは瘢痕形成を起こさせる因子の絞り込みを行った。　同時に皮膚が完全に再生するマウス胎生１３日の創傷部位に特異的に発現が認められたtwist2のノックアウトマウスを購入し、飼育して繁殖させ、これらの妊娠マウスを使用し、胎生13日および胎生15日胎仔マウスに創傷を作成し、創傷作成後の創閉鎖、形態の変化を調べた。

【研究の社会的意義】

本研究により、マウス胎仔皮膚再生に関与する分子が、皮膚の再生に関与している可能性が示唆された。今後、これらを操作することで、瘢痕を抑制する分子の開発につながる可能性が示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】25293363 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

皮膚 / 再生 / 胎仔 / 創傷 / 再生医療 / レーザーマイクロダイセクション / マイクロアレイ

【研究成果の概要】

哺乳類の胎仔の皮膚に実験的に傷をつけても、胎生期のある時期までは傷は素早く、そして瘢痕を残すことなく治癒し、皮膚は完全に元通りに再生する。われわれは、胎生13日までのマウス胎仔の皮膚に創傷を作成しても完全に再生するが、胎生14日以降の胎仔は再生せず傷跡を残すことを発見した。これをもとに、組織切片からレーザーマイクロダイセクションを用いて、胎生１３日と１５日の創傷部の表皮、真皮別にRNAを採取して、正常皮膚と比較することで、胎仔皮膚再生のメカニズムに迫った。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】17390477 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

創傷治癒 / 皮膚 / 再生 / 胎仔 / 発生・分化 / マイクロアレイ / siRNA / 変換点

【研究成果の概要】

皮膚が再生する時期と再生しなくなる時期のマウス胎仔皮膚から、マイクロアレイにより得ることができた、皮膚を再生させる候補遺伝子をin vitro及びin vivoで胎仔皮膚創傷面から消失させることで、これら候補遺伝子の皮溝、皮丘、真皮の癒痕の形成与える影響につき検討した。siRNAを用いた機能解析のスクリーニングのため、マウス胎仔皮膚を用いたin vitroのスクリーニングモデルを開発した。Genechipを用いた皮膚再生を引き起こす候補遺伝子の中で、in vitroおよびin vivoの胎子創傷治癒モデルで、皮膚再生に機能的に作用のあった遺伝子はtwist, fbn1であった。これらをsiRNAにより、成獣マウス創傷部位からノックダウンを行って、癒痕形成、皮溝、皮丘の形成に与える影響を観察した。遺伝子導入は、リポフェクション試薬を用いて行ったが、創傷部位で効果的にノックダウンを行うことが可能であった。その後、成獣の創傷部位でtwist, fbn1のノックダウンを行い、効率的に創傷部位でのノックダウンは行えたが、療痕形成、皮溝、皮丘の形成に作用を及ぼさなかった。
また、スキッドマウスの背部での胎仔皮膚再構築モデルを用いて、マウス胎仔真皮間葉系細胞のshh, twist, fbn1のノックダウンを行い、再構築された皮膚の組織学的構造の変化、皮溝、皮丘の形成に与える影響を検討した。その結果、shhのノックダウンで毛包の再構築が抑制され、twistのノックダウンできめの再構築が乱された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】15,500千円 (直接経費: 15,500千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】16659488 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

スキッドマウス / siRNA / きめ / 皮溝・皮丘 / 再生 / 胎仔 / 創傷治癒 / scarless / 免疫不全マウス / 混合移植

【研究成果の概要】

免疫不全マウスC.B-17/Icr-scidJcl、オス8週から12週の背部に直径8皿の皮膚全層欠損層を作成し、ここにC57bl/6Jマウスの胎生17日の胎仔のそれぞれ表皮と真皮をディスパーゼで分離し、トリプシン処理でそれぞれ細胞を浮遊させた後、1x10^7個ずつ背部皮膚全層欠損層に表皮細胞と真皮細胞を混合移植し、テフロンキャップで被服した。4週後に皮膚表面をダーマスコープで観察するとともに、組織像で皮膚の再生の有無を観察した。
発生過程の胎仔正常皮膚および混合移植皮膚を4%パラフォルムアルデヒドで固定し、これらの物質につき、免疫染色、in situ hybridizationを用いて発現の差異を解析した。
胎生17日の表皮ならびに真皮細胞を組み合わせたモデルで、siRNAが効率的に導入できるかを、真皮細胞側にリポゾームを用いてlamin A/Cを導入した後に、表皮細胞、真皮細胞の混合移植を行った。またGFP発現ベクターをリポフェクション法により真皮細胞に導入し、遺伝子導入の効率を観察した。また真皮細胞にエラスチン、fiberillinなど、これまでに皺の形成に関係していると考えられている物質につき、やはりsiRNAで発現をブロックし、混合移植を行い皮膚の性状を観察した。混合移植後28日目に再構築された皮膚表面の形状を、ダーマスコープで観察し、遺伝子操作を加えていない皮膚再構築モデルの皮溝、皮丘の形成状況とを比較した。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】15390541 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胎仔 / 創傷治癒 / Genechip / sonic hedgehog / real time RTPCR / 皮膚 / 再生 / きめ / 皮溝 / 皮丘

【研究成果の概要】

皮溝、皮丘のパターンは"きめ"あるいは皮膚の質感と呼ばれているもののひとつで、体の部位によって違う。本研究は多くの形成外科領域に関係する皮溝、皮丘のパターンの形成メカニズムについては研究を行うことを目的としている。皮膚が完全に再生するマウス胎仔創傷治癒のモデルを用いて、胎生13日の胎仔創傷治癒と胎生14日の胎仔創傷治癒を比べ、皮溝、皮丘のパターンの形成メカニズムの探求を行っている。
sonic hedgehog, indian hedgehog, desert hedgehog, gli-1,-2,-3, smoothened,elastin, fibrillin, fiburinについての発現を免疫組織学的に検討した。その結果、sonic hedgehogは胎生13日の創傷治癒では発現は認められなかったが、胎生14日以降の創傷治癒では過剰発現していた。sonic hedgehogの下流のgli-1,-2,-3,smoothenedはいずれの場合も発現していて、sonic hedgehogの発現の有無が皮溝、皮丘の形成をコントロールしている可能性があった。Genechipによる解析では、胎生13日と14日の創傷治癒過程で発現差異のある物質は数多く観察されたが、発生の段階による違いによるものがほとんどであった。エラスチン関連物質では、胎生13日と14日の創傷治癒での発現の差は見られなかった。
その他の胎生13日の創傷治癒過程で発現していて、胎生14日の創傷治癒で発現していない物質として、Igals9,cluなど12遺伝子が、逆に胎生14日の創傷治癒過程で発現していて、胎生13日の創傷治癒で発言していない物質としてHba-x, Lrp-1など9遺伝子が見つかった。これらはreal time RTPCRで定量的に確認され、また免疫染色により創辺縁での発現が確認された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】11,000千円 (直接経費: 11,000千円)