【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】15500267 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

carbon monoxide / nitric oxide pial / microcirculation / NO imaging / diaminofluorescein / nitric oxide / pial microcirculation / nitric oxide synthase

【研究成果の概要】

ガス状メディエータは生体内で生成される低分子で細胞膜を他の物質に比べて容易に通過して蛋白質や脂質・糖質・核酸などの他の生体構成成分と特異的に結合する分子群である。このような分子群のうち一酸化窒素(NO)や一酸化炭素(CO)のみならず、生体内でcysteineの分解にともなって生成される硫化水素(H_2S)が神経伝達や血管弛緩に関わる新しい分子として注日されている。本研究はCOやNOやH_2Sのガス分子が高レベルで存在する脳組織をモデルに、これら複数のガス分子が生物活性を発揮するメカニズム及び神経・血管系におけるガス分子の生成及び受容機構を包括的に解明することを目的とした。我々は、これまでにラット脳をモデルとした脳微小循環実験系においてCOが血管収縮性作動物質として作用するという証左を得た。つまり脳実質に高発現する構成型CO産生酵素であるheme oxygenase(HO)-2由来のCOを抑制すると細動脈の拡張が起こりCOを添加すると収縮が起こること見い出した。しかしながら、これらのガス分子が生体内で統合的にどのように生理活性調節を行っているかのメカニズムは未解決である。脳は自律神経支配に極めて乏しい組織でありneuromodulatorとして確立されつつあるCOやH_2Sのガス分子がアセチルコリン、コリン非依存性のvascular regulatorとして作用している可能性を探究することを目的とし、実験を進めた。本研究期間の主な成果としては、ラット脳表微小循環においてのNO産生量をin vivoで視覚化するため、蛍光NO指示薬であるdiaminofluorescein diacetate (DAF-2DA)を用いたreal-timeでのNO-imaging実験系を構築した。その結果HO阻害剤であるzinc protoporphyrin IX(ZnPP)の脳表灌流により、脳表細動脈壁および細静脈壁におけるNO産生量の増加が観察された。このことから、定常状態のラット脳表微小循環では、恒常的に産生されるCOがNO合成酵素の活性を阻害している可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】麻酔・蘇生学

【研究領域課題番号】14370495 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

敗血症 / 輸血 / 微小循環 / ヘモグロビン / 腸管壁防御機構 / 一酸化窒素 / 一酸化炭素 / 内毒素血症 / ヘムオキシゲナーゼ

【研究成果の概要】

本研究では「輸血によるヘム負荷がストレス応答酵素ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)が誘導されるような侵襲下においては過負荷となり、生体防御機構のバランスを崩す」という仮説を基に、平成14年から3年間に渡り研究を行った。正常ラットに比べ、亢進している内毒素血症ラットの腸管壁透過性は、輸血による高ヘモグロビンでさらに増強することを見出した。そこで、ストレス応答酵素HO-1をヘミン投与により予め誘導したラットを用いて検討したが、輸血ならびに血液希釈ラットを含め交換輸血後、16時間以内に全例が死亡した。死亡前のラット腸管壁におけるHO-1誘導を免疫染色したところ、少なくとも腸管粘膜へのHO-1表出は顕著ではなく、その関与が否定的となった。さらに、HO-1誘導時に同時産生されるビリルビン値は高ならびに低ヘモグロビンラット共に測定限界以下で、HO-1過剰誘導を示さなかったことから、高ヘモグロビンによる内毒素惹起性腸管壁透過性の増強は、HO-1誘導に起因するものではないといえる。さらに生体顕微鏡下により腸管粘膜微小循環を観察したところ、正常ヘモグロビンラットに比べ、高ヘモグロビンは毛細血管密度を含め微小循環を阻害する}方、低ヘモグロビンはほぼ正常に近い赤血球速度を含め微小循環ならびに毛細血管蜜度を維持した。さらに高ヘモグロビンでは、内毒素血症ラットで認める血流停止と再開を繰り返す現象をさらに増強した。一方、低ヘモグロビンラットは変化をきたさなかった。また一酸化窒素(NO)ドナーを表面灌流したところ、微小循環血流は改善し、NO合成酵素(NOS)阻害薬L-NAMEによりNOを抑制したラットにおいては、腸管粘膜微小循環血流はいずれの群においても著しく阻害された。これらの所見より、腸管粘膜におけるNOS誘導が高ヘモグロビンで高まる免疫染色所見と一致し、NOが高ヘモグロビンによる内毒素惹起性腸管壁透過性亢進に関与していることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】12,000千円 (直接経費: 12,000千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】14370063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ヘムオキシゲナーゼ / 一酸化炭素 / 可溶性グアニル酸シクラーゼ / 一酸化窒素 / 遺伝子改変動物 / シスタチオニンベータシンターゼ / シスタチオニン合成酵素 / 硫化水素 / アミノ酸置換体 / ノックアウト動物 / heme oxygenase / cystathionine β synthase / 胆汁分泌 / microcirculation / heme oxgenase / carbon monoxide / nitric oxide / hypoxia / soluble guanylate cyclase / conditional knock out mice / cystathionine beta synthase

【研究成果の概要】

ヘムを一酸化炭素(CO)、鉄およびビリベルジンに分解するヘムオキシゲナーゼ(HO)は多彩な生物活性を有していることが知られているが、HOアイソザイム固有の生理活性の発現とその調節機構、COにより制御される標的分子の検索、さらに生体内で産生される他のガス分子との相互作用について未だその全貌が解明されていない。本研究課題では、HOアイソザイム発現とCOなどの反応生成物を介した生物作用発現との関係を明確に議論できる実験系を確立し、本酵素活性の生体制御における病態生理学的意義について解析することを目的としてきた。この目的遂行のために、既に報告のあるHO遺伝子欠損で認められる繁殖不全を回避できるOre-LoxPシステムに基づいた新しいコンディショナルノックアウトマウスの作成に着手し、現在までに目的とした相同組換えを起こしたES細胞を用いてキメラマウスの作成に至っている。次に、COにより特異的に作動する新規細胞内レセプタの検索を行うために、COにより惹起される細胞内代謝変動をCE-MSを用いて解析した。その結果、アセトアミノフェン投与による肝臓内CO産生増加に伴い、肝臓内メチオニンの増加とS-アデノシルメチオニンおよびシステインからグルタチオンやタウリンに至る代謝経路の抑制が認められた。この結果より、メチオニンからシステイン合成に至る含硫アミノ酸代謝経路に存在するcystathionine β-synthase(CBS)がCOの新しい細胞内標的分子であることが明らかになってきた。また、CBS精製蛋白を用いてCOによる酵素活性阻害様式を解析した結果、数mMのCOによりCBS活性阻害が認められるがこれはヘムの2つの軸配位子のうちシステイン残基がCOと置換することで生じることが明らかになった。さらに我々はCOと別の内因性ガス状メディエータである一酸化窒素(NO)と生体内における相互作用について解析した結果、網膜組織内において両者の既知標的分子である可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)活性を局所で産生されるCOとNOが協調して制御しており、このCOによるsGCの活性制御は局所のNO濃度に強く依存していることが明らかになった。本研究期間でHO-CO系を介した新たな生物活性を見出すことが出来たが、今後我々が取り組んでいる新規遺伝子改変動物の利用により更なるHOの生物学的意義の解明を行う必要があると考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】11,200千円 (直接経費: 11,200千円)

【研究分野】麻酔・蘇生学

【研究領域課題番号】13557132 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

heme oxygenase / Oxygen carrier / Hemoglobin / microcirculation / nitric oxide / bilirubin / carbon monoxide / Kupffer cells / NO / CO / 微小循環 / ヘモグロビン / バイオイメージング / ビリルビン / hme oxygenase / リポソーム / 一酸化炭素 / 酸素 / ヘムオキシゲナーゼ / シトクロームP450 / 肝臓

【研究成果の概要】

肝臓・網内系は修飾ヘモグロビン(Hb)の主要な代謝コンパートメントである。ショック病態で救急救命に使用できる酸素運搬体はこれらの病態においても肝臓の恒常性を維持しつつ循環動態を改善できるスペックを持つ必要がある。本研究ではショック病態の肝臓ではヘムの分解代謝の動態が劇的に変動し、通常では考えられないような速度で肝臓に取り込まれたヘムがbilirubinに変換されることを明らかにした。これはストレス応答によりヘム分解酵素であるheme oxygenase (HO)-1が肝臓実質とKupffer cellで誘導されるためである。このような状況で肝臓に大量のHbが負荷されると肝臓の血流と胆汁を維持しているCOが捕捉、消去されてしまうため、血流低下や胆汁低下を来たすことが明らかになった。ヘモグロビン(Hb)を径250ミクロン大のliposomeに封入、表面をpolyethylene glycolで修飾して、血小板活性化能のない新規脂質で安定化させた試料を投与すると、そのような急速なヘムの分解や分解系酵素の誘導が抑制され、肝臓の血流や胆汁分泌が維持された。またビリルビンの表面修飾によりNOによるHbのメト化も部分的に抑制された。本研究ではHb-based oxygen carrierを体内投与した際に生じうる血管内皮細胞の機能変動をin vivoで評価する系としてNOのbioimaging技術を確立し、腸間膜における血管内皮細胞由来のNOのリソースについて重要な知見を得た。これまでNOのリソースは血管内皮と神経系と考えられてきたが、我々の得た知見は赤血球から供給されるリソースの存在を示唆するものであった。このような知見からHbを修飾した酸素運搬体ではこのような血流代償作用が期待できないことが示唆され、リポソーム型の場合であっても、血管内空間でリサイクルされるNOにどの程度の影響を与えるのかをさらに詳細に解析していく必要があると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】麻酔・蘇生学

【研究領域課題番号】12877247 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血小板 / 血管内皮細胞 / 接着分子 / 微小循環 / 吸入麻酔 / 一酸化炭素 / 一酸化窒素

【研究成果の概要】

本研究では、超高速度カメラと血小板染色蛍光色素(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester : CFDASE)を用いて、ラット腸間膜微小循環系における吸入麻酔中の血小板接着反応を生体顕微鏡下で観察・解析した。その結果、セボフルランは毛細血管後細静脈における血小板の辺縁移行(margination)と赤血球速度に対する血小板速度比(V_P/V_R ratio)が低下し血小板-血管内皮細胞接着反応を惹起すること、さらにストレス応答酵素ヘムオキシゲナーゼ-1とその最終ヘム代謝産物であるガス状メディエーター一酸化炭素により抑制されることを初めて明らかにした(Anesthesiology2001;95:192)。また、ハロセン麻酔下においても生体内の血小板動態が不均一であること、血管内皮細胞表面との接着を繰り返していること、さらに可逆性のある麻酔薬惹起性血小板接着現象を確認し、現在投稿中である。以上の研究により、生体外では臨床使用濃度の麻酔薬により抑制される血小板機能は、生体内においてはむしろ賦活化されることを初めて明らかにした。研究者らは以前、白血球接着反応が臨床使用濃度の吸入麻酔により惹起され、組織障害の素因を形成する可能性を示した(Anesthesiology 1997;87:591)。本研究において、麻酔中の血小板動態も白血球とほぼ同様に賦活化されることを示し、現在は血小板が白血球動態にどのような影響を及ぼしているかを検討する計画を立てている。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】800千円 (直接経費: 800千円)

【研究分野】胸部外科学

【研究領域課題番号】12671328 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

転移性肺腫瘍 / 肺循環 / 微小循環 / 人工酸素運搬体 / 一酸化窒素 / 共焦点レーザー顕微鏡 / 肺微小循環 / 腫瘍循環 / 肺微少循環

【研究成果の概要】

肺末梢領域に発生する腫瘍の増殖する環境は、酸素と血流の点で他臓器の固形腫瘍と異なると考えられる。また、肺腫瘍の微小循環を明らかにする上で、syngenicな腫瘍に対するものであるのかalloやxenogenicな腫瘍に対するものであるかによって腫瘍循環の成立が異なることが予想される。転移性肺腫瘍に対する腫瘍循環の成立を調べるためには同種の腫瘍を用いた肺転移モデルが必要である。
われわれは、石英ガラス製のWindow chamberを胸壁に設置し、レーザー共焦点顕微鏡を用いて肺微小循環の観察を行った。FITCアルブミンにより血漿の可視化した。血流速度の測定は赤血球をFITCによって標識し、血流を記録した画像上でフレームごとの赤血球の動きを計測して求めた。
Donryuラットに自然発生した腹水型肝癌LY80を用い、腹水から調整した腫瘍細胞を腹腔内移植、皮下移植、尾静脈注入、開胸移植、皮下腫瘍を細切して尾静脈より注入する5種類の方法でDonryu ratに移植し、肺転移の形成能を検討した。その結果、皮下腫瘍塊を細切し、尾静脈注入を行うことにより比較的安定した肺転移巣を作成することができた。観察期間は腫瘍移植後15日から17日と考えられた。
正常肺循環では約80μの細小肺動脈から肺胞毛細血管にいたるまで微小循環を明瞭に観察することが可能であった。オキシHbの静脈内投与により、細小肺動脈の収縮と、右室圧の上昇を認めたが、HbVでは一過性の肺動脈内径の減少と一時的な右室圧の上昇が認められた。
腫瘍循環の評価系のあるLY80を用いて皮下腫瘍細切腫瘍塊尾静脈注入による肺転移巣作成が可能となったが、腫瘍が成長する段階で、血性胸水が増加し、癌性胸膜炎が進行して胸水による呼吸不全で死亡する動物がほとんどであったため、腫瘍の成長と腫瘍循環の成立を十分に観察できたとはいえなかった。このため、腫瘍内の酸素分圧、酸素代謝状態の検討は今後の課題として残った。肺転移が成立する初期の段階では、腫瘍は拡張した肺胞毛細血管に取り巻かれており、一酸化窒素を捕捉するオキシヘモグロビンの投与によっても拡張した肺胞毛細血管には変化を認めなかった。今後細胞株を変更して他の転移性肺腫瘍でも同様の所見が認められるかを検討する必要がある。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】09470143 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

heme oxygenase / 一酸化炭素 / 一酸化窒素 / cytochrome P450 / 伊東細胞 / guanylate cyclase / カルシウム / 肝細胞 / ヘムオキシゲナーゼ / 微小循環 / 血管内皮細胞 / ヘモグロビン

【研究成果の概要】

我々は肝臓で内因性に生成される一酸化炭素(CO)が類洞血管抵抗を生理的レベルに低く保つために必要不可欠である内因性血管弛緩因子であることをラットを用いた実験的研究で世界で初めて明らかにした。この結果を基盤として本研究の平成9、10年度ではCOが肝臓における胆汁酸依存性胆汁輸送の内因性抑制物質であることを明らかにすると同時に、そのメカニズムとして同じガス状物質であるNOのようにミトコンドリアの呼吸鎖の抑制には直接関係せず、胆汁分泌系の起始部である毛細胆管の律動的収縮運動に対する抑制効果が関与すること、その場合COのレセプター分子としてcytochrome P450 epoxygenaseが関与し、細胞内カルシウムの動員抑制が抑制効果の本態であることを明らかにした。この結果はCOの新しい情報伝達系が提示された意義とともに、従来情報伝達系と考えられてきたsoluble guanylate cyclaseを介さない経路が存在することを示唆している点で極めて重要な成績である。一方COの生成酵素であるheme oxygenaseのアイソザイム(HO-1,HO-2)の肝臓における分布は全く明らかにされていなかったが、前者が、類洞内に分布するKupffer cellに、後者が類洞外の肝実質細胞に分布することが新規に作成した単クローン抗体による免疫組織学的検討で明らかにされ、類洞外空間(HO-2)で生成されたCOが血管周皮細胞である伊東細胞を弛緩させて血管抵抗が恒常的に低く保たれることが示された。本酵素のアイソザイムが臓器内の特定の細胞群に特異的に発現していること、それらの生理学的意義が明らかにされたのも初めてのことである。今後、HO-1の転写活性を上昇させる刺激として、低酸素、活性酸素、サイト力インなどの役割に着目し、これらの侵襲因子が上昇することが知られている小児外科領域でのtotal parenteral nutrition使用後のcholestasisや高血圧動物モデルにおける血管トーヌス異常におけるHO反応の役割をさらに検討する予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】5,100千円 (直接経費: 5,100千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】06454264 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

一酸化炭素 / 一酸化窒素 / ヘムオキシゲナーゼ / 微小循環 / 伊東細胞 / 肝臓 / 胆汁うっ滞 / ビリルビン / heme oxygenase / 一酸化窒素ラジカル / cGMP / 肝類洞循環

【研究成果の概要】

新年度末に明らかになった内因性一酸化炭素(CO)による肝血管抵抗の調節作用を示す成績から、COの作用部位の特定を明らかにするため、肝実質細胞,類洞内皮細胞,伊東細胞を初代培養し、CO,NOによるcyclic GMPの反応を検討した。その結果、伊東細胞は可溶性グアニレートシクラーゼ活性が極めて高く、CO数μMに反応してcGMPが上昇することが示された。一方分離灌流肝を用いた系において、COの生成酵素であるヘムオキシゲナーゼの阻害剤を投与すると肝血管抵抗が上昇するのに伴い、類洞血管の不連続性狭小化が起こること,狭小化部位に一致して伊東細胞が局在することが明らかとなった。以上のことから、類洞のトーヌスが肝実質から生成されたCOが伊東細胞に作用し、cGMP依存性に調節されることが示された。肝実質細胞のCOはそれ自身に作用し、何らかの生物活性を発揮する可能性が考えられるが、ヘムオキシゲナーゼが胆汁色素の代謝のkey Enzymeであることを考慮し、COが胆汁流量の調節因子である可能性の検証を試みた。ラット分離灌流肝において、ヘムオキシゲナーゼ阻害剤Zinc protoporphyrin IXの投与により胆汁流量は灌流液中に胆汁酸が存在するときに有意な増加を示した。また肝細胞における胆汁排泄のmotivation forceとなる毛細胆管の収縮間隔を、培養肝細胞のtime-lapse video microscopy で解析したところCOの抑制により収縮回数の増加が認められた。しかしながらこの現象にはcGMPの関与は否定的であり、一方、細胞内ATP量がヘムオキシゲナーゼの阻害により上昇することから、現在COが細胞内ATPを変動させ、K^+チャネルの機能を変化させる可能性を検討している。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】7,200千円 (直接経費: 7,200千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】02557036 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微小循環 / 酸素ストレス / 癌細胞 / 細胞障害活性 / Kupffer細胞 / 好中球 / nitric oxide / デジタル生体顕微鏡 / 脂質過酸化反応 / 肝障害 / redox state / 細胞障害性 / 活性酸素 / デジタル画像解析 / 臓器微小循環 / 虚血性肝障害 / クッパ-細胞 / ヒト肝癌細胞株 / NADH自家蛍光

【研究成果の概要】

当該年度では,臓器微小循環における酸素ストレスの動的解析を特に癌細胞に対する細胞障害性の面から検討した.腫瘍細胞が生体内に発生すると,まず免疫担当細胞の攻撃を受け,この攻撃から免れた腫瘍細胞がクローン化して臨床的に癌と把握されるわけである.平成3年度までに得られた結果から,生体内では酸素ストレスが種々の細胞に対して障害性を発揮していることが明らかとなった.従って,癌細胞に対する障害細胞に酸素ストレスを生ずる能力が強ければ,その細胞は癌細胞を排除する能力も大きいと判断される.大腸癌の肝転移モデルを作製し,肝臓に流入した大腸癌細胞に対して肝内のKupffer細胞が酸素ストレスを介して障害することをin vitro,in vivoで証明した.別に,ラット肝癌細胞とラットKupffer細胞を用いてoxidativecytotoxicityを解析した.Kupffer細胞は癌細胞のミトコンドリア機能を障害することが蛍光色素であるローダミン123を用いた実験で明らかとなった.この作用はnitric axide(NO)の阻害剤で阻止されたことからKupffer細胞のミトコンドリア機能を介した細胞障害作用はNOによるものと考えられた.さらにこの作用は癌細胞とKupffer細胞の接着が必要で,その際,細胞接着分子ICAM-1の関与が示唆されている.ヒトの系においてはヒト肝癌細胞とヒト好中球の反応を検討した.好中球の細胞障害活性は酸素ストレスを介したものであり,この作用は免疫賦活剤であるOK-432により有意に増強した.しかし,リンパ球の細胞障害は酸素ストレスとは無関係であり,両者の細胞の障害機序は全く違うものであることが証明された.以上の現象をin vivoにて検討する目的でヌードマウスにヒト肝癌細胞を移植し,その腫瘍を生体顕微鏡下に観察したが,腫瘍の形状が不整で,しかも堅い性状であるため腫瘍内の臓器微小循環の観察がたいへん困難であった.今後の課題である.

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1992

【配分額】16,800千円 (直接経費: 16,800千円)