【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】10878131 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JAK / STAT / CIS / エリスポエチン / インターフェロン / シグナル伝達 / チロシンキナーゼ / 細胞分化

【研究成果の概要】

我々は赤芽球様細胞ELM-1を用いてエリスロポエチン(EPO)による赤血球分化の研究を行っている。我々はEGF受容体とEPO受容体のキメラ分子を作成し、さら受容体のチロシン残基に変異を導入することで受容体細胞内ドメインの2つのチロシン残基(Y343、Y401)のいずれかが赤血球分化に必須であることを証明した。これら2つのチロシン残基はSTAT5の活性化に必要であり、STAT5と分化は密接に関連していることが考えられた。しかしながら一方IL3受容体やプロラクチン受容体とのキメラを作成して本細胞に導入したところこれらのキメラ分子はSTAT5を活性化するもののこの細胞の赤血球分化は誘導しないことを明らかにした。したがってIL3受容体になくEPO受容体に特異的な分化シグナルが存在し、STAT5とともに分化の促進に働くと考えられる。そしてそのシグナルの発生にはEPO受容体のY343、Y401のいずれかのりん酸化が必要であることが示唆される。この2つのりん酸化チロシン残基と会合する分子をクローニングするためりん酸化ペプチドによる精製を行った。アミノ酸配列決定の結果これらのペプチドにSTAT5とポスフォリパーゼCγ-2(PLC-γ-2)が会合することを明らかにした。PLC-γ-2の赤血球分化における役割を明らかにするために現在阻害剤やドミナントネガティブフォームを導入する実験を行っている。さらに酵母two-hybrid法による組織的スクリーニングを行うために、JAK2チロシンキナーゼを共発現させたスクリーニング系を開発した。これにエリスロポエチン受容体細胞ドメインをbaitとして様々なライブラリーをスクリーニングしたころフォスファチジル酸キナーゼのp55サブユニットなどが同定できた。新規分子も多数あり現在解析中である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1998

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】10557038 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / チロシンりん酸化 / インターフェロン / SH2ドメイン / シグナル伝達 / APS

【研究成果の概要】

我々は活性化型c-kitやc-fmsを用いたtwo-hybrid法によって新規チロシンキナーゼ基質のスクリーニングを行い、これまでにAPS、STAP-1,2などの新規分子をクローニングした。さらに今回SH2ドメインなどを持たない全く新しいタイプの基質WARSを単離した。本分子にはショウジョウバエでRas-MAPキナーゼ抑制系に働くことが明らかにされているある分子に類似したドメインを有する。非常に興味深いことにWARSの強制発現によってEGFによるRasの活性化が抑制された。今後各種がん細胞での発現を調べ、本遺伝子を強制発現させた場合の造腫瘍能や転位能について調べる。さらにノックアウトマウスを作成して生理機能を明らかにする予定である。
さらに酵母two-hybrid systemによってJAK2のキナーゼドメインと直接結合しそのキナーゼ活性を抑制する分子JAB(JAK-binding protein)を見い出した。JABはJAK2のチロシンキナーゼドメインに直接結合し、その活性を抑制することを見い出した。JABの生理機能を明らかにするためにJABノックアウトマウスを作成した。JABノックアウトマウスは正常に生まれてくるが生後3週間以内に全て死亡し、胸腺、脾臓の萎縮と肝臓での脂肪の蓄積および多くの組織での炎症様の単球の侵潤が見られた。これらの表現型の一部はIFNγトランスジェニックマウスに似ている。実際JAB-/-マウスとIFNγ-/-マウスとのかけあわせによって症状が全く見られなくなった。しかしそればかりでなくRag2-/-マウスとのかけあわせによっても症状は消失した。さらにJAB-/-マウスの骨髄細胞をJAK3-/-マウスに移植するとリンパ球は再構築されるもののやがてマウスは死亡した。したがってJAB-/-による個体の死はT細胞とインターフェロンγに依存することが示された。JABはT細胞においては活性化を抑え、非リンパ系細胞ではIFNγ感受性を決める分子であることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】12,300千円 (直接経費: 12,300千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】09470036 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / エリスロポエチン / 胎児造血 / エリスポエチン / エリスロポエチン受容体 / シグナル伝達 / 細胞分化 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

赤血球造血の制御機構を解明するために我々は造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子の解析を行った。まず骨髄細胞をセルソーターにて造血幹細胞を分画し、この細胞集団からPCR増幅を経てcDNAライブラリーを作成した。これを酵母two-hybrid用のベクターに組み込み、c-kitをbaitとしたスクリーニングを行った。その結果STAP-1と呼ぶ新規遺伝子をクローニングした。この遺伝子はPleckstrin homology(PH)ドメイン,Src homology 2(SH2)ドメインを有するアダプター分子でc-kitによってチロシンりん酸化された。RT-PCRの結果、STAP-1の発現はc-kitを有する骨髄細胞に限局することが明らかとなった。また最も高い発現はCD34 low/-Sca-1+c-kit+Lin-の幹細胞分面に得られた。現在生化学的な解析を行っている。
次にエリスロポエチン受容体からのシグナルを制御する分子として、我々がクローニングしたCIS3の機能解析を行った。CIS3は胎児肝臓の赤芽球前駆細胞に強く発現していた。生理機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作成した。CIS3-/-ノックアウトは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5-15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】13,400千円 (直接経費: 13,400千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07559018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 造血因子 / RAS / STAT / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 造血 / JAK / レトロウイルス / アポトーシス / サイトカイン受容体 / JAKキナーゼ / 転写因子 / 分化

【研究成果の概要】

本研究では、IL-3/GM-CSFにより活性化される主要なシグナル経路であるRasとSTAT5の機能解析を行うとともに、それらの変異分子の作成と発現によるシグナル経路の制御法の開発を目指した。
サイトカインによる造血細胞の細胞死の抑制にRASの活性化が重要である。そこで、部分活性型RAS変異体を用いて細胞死抑制のシグナル解析を行った。その結果、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とP13キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していることを明かにした。また、サイトカイン除去により誘導される細胞死においても、FASなどによる誘導的な細胞死と同様にCaspase-3が活性化されること、さらに、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることを示した。しかし、RASによる細胞死の抑制とCaspaseの活性との関連は現在検討中である。
IL-3/GM-CSFなどの造血因子がSTAT5を活性化することを見出していたが、そのサイトカイン機能における役割は不明であった。そこで、STAT5の標的遺伝子のクローニングを行い、SH2ドメインのみをもつ新規分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatinM(OSM)などを得た。CISはSTAT5により誘導される分子でSH2ドメインによりチロシンリン酸化された受容体などに結合してサイトカインのシグナルを抑制する負の調節分子であることを証明した。また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。
優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)