【研究分野】蚕糸・昆虫利用学

【研究領域課題番号】12306003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カイコ / ESTデータベース / 平均化ライブラリー / 神経ホルモン / ジーンターゲッティング / フェロモン / バキュロウイルス / 遺伝子導入 / GFP

【研究成果の概要】

神経ホルモンPBANにより制御されるカイコガ性フェロモン産生系をモデルとして、ホルモンによる昆虫機能発現の分子機構解析を試みた。まず、カイコ純系系統p50フェロモン腺の平均化cDNAライブラリーより構築したフェロモン腺ESTデータベースから浮き彫りにしたフェロモン腺特異的遺伝子の解析を行った。その結果、フェロモン生合成酵素であり、かつ、フェロモン成分の種特異性を規定するキー酵素でもある不飽和化酵素(Desat1)およびアシル基還元酵素(pgFAR)の性質を明らかとし、これら酵素の基質特異性がフェロモン成分の厳密な成分割合の決定に重要な役割を担っていることを示した。これらの成果の一部は米国科学アカデミー紀要(PNAS,2003年8月5日号)に掲載され、その表紙を飾った。また、PBAN受容体遺伝子のクローニングに成功し、これがロドプシン受容体ファミリータイプのGPCRであることを示すとともに、昆虫培養細胞での機能発現を行い、その基本的性質を明らかにした。さらに、メス成虫の血リンパより、フェロモン腺特異的遺伝子pgACBPの転写を活性化する因子を単離し、その構造をβ-グルコシル-O-チロシンであることを明らかにした。
一方、機能発現に関わる昆虫遺伝子の機能を包括的に解析するツールとして、カイコでのジーンターゲッティング法の開発に向けた方法論の確立を試み、Golicらによって開発された相同組み換えによるジーンターゲティング法のカイコへの適用を行った。現在、この手法の実施に必要なFLP部位特異的リコンビナーゼとI-SceIエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入したトランスジェニックカイコの作成と、標的配列に相同なDNAから成るドナーコンストラクトの構築を進めているが、この最新の形質転換技術をカイコでの系に応用することはノックアウトカイコの作製を可能とするものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2003

【配分額】47,600千円 (直接経費: 40,100千円、間接経費: 7,500千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】08457202 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エンドセリン / ジーンターゲティング / 血管形成 / 血管リモデリング / トランスジェニックマウス / 遺伝子導入 / 組織特異性 / 遺伝子治療

【研究成果の概要】

血管形成・リモデリング機構の解明のため、本研究ではまず、血管系特異的な遺伝子発現系の確立を目的とし、エンドセリン-1(ET-1)遺伝子プロモーター領域を用いた血管壁選択的遺伝子発現トランスジェニックマウスを作成した。
1.エンドセリン-1(ET-1),アドレノメデュリン(AM)過剰発現マウス:ET-1過剰発現マウスの組織・血中ET-1濃度は野生型マウスの2〜4倍で、低体重と体毛の減少を認めたが、無麻酔無拘束下またはウレタン麻酔下での観血的動脈圧は野生型に比べ差はなく、生理的にみられる程度のET-1の産生増加は、慢性期では血圧レベルに影響しないと考えられた。AM過剰発現マウスのうち1系統は、大動脈AM濃度は野生型マウスの約10倍であった。
2.血管系選択的コンディショナル遺伝子発現マウス:テトラサイクリン反応性オペレーター遺伝子配列(tetO)にレポーター遺伝子(LacZ)を結合したコンストラクト(A)、ET-1プロモーター領域9.2kbにテトラサイクリンプレッサー蛋白(tetR)とVP16C末転写活性化領域の融合蛋白を結合したコンストラクト(B)をそれぞれ作成し、A・Bそれぞれより各々複数のラインを得た。tetOによるLacZ発現をin vitroで確認した後、現在それぞれの系の交配を進め、両方のコンストラクトが組み込まれたマウスの樹立行っている。
以上から、この血管壁遺伝子発現系による遺伝子発現は生理的産生量に匹敵もしくは凌駕するレベルを示し、血管系における遺伝子機能解析への高い応用性が示された。さらに、コンディショナル遺伝子発現系の応用により、血管系でのテトラサイクリンによるON-OFFの調節が期待される。現在、ウイルス系ベクターを用いた遺伝子導入へ向けての準備を進めている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)