Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

蛋白質-蛋白質間の相互作用による細胞内シグナル伝達機構を明らかにするためにSmadに結合する蛋白質をマススペクトロメトリーで同定することを目的として実験を行った。Smad1〜8にFla-tagをつけたコントラクトを作り哺乳類細胞にトランスフェクションした。ついでアガロースピーズに結合した蛋白質をFlag抗体を用いて免疫沈降し、共沈する蛋白質を銀染色したSDS-PAGEから切りだし、トリプシン処理したのち、マススペクトロメトリーによってペプチドの質量を測定した。その結果、Rabファミリーのタンパク質がSmad1と結合することが明らかとなった。
Smad3はCAGAというモチーフに活性化された時にのみ結合することから、CAGA sequenceを用いてDNA affinity purification (DNAP)によるSmad3の回収を試みた。その結果、HaCaT細胞ではSmad3はTGF-βによって活性化されたときにのみ特異的にCAGA sequenceに結合し、さらにSmad2も共沈することが確認された。また転写共役因子であるp300やc-SkiがSmad3とともに回収できることが確認された。
結合タンパク質の特異的な回収のためにはPoly d(1-C)の濃度の決定、ビーヅの洗浄の条件、DNAとの反応時間の設定などが重要であることが確認された。またダイナビーヅを用いることによって、タンパク質を銀染色で調べた場合、劇的にバックグラウンドが低くなることが明らかとなった。以上からDNAPを用いることによって細胞内に存在するSmad結合タンパク質を活性化された時に特異的に効率良く回収できることが明らかとなった。

【研究分担者】
今村健志	癌研究所生化学部	主任研究員	(Kakenデータベース)