【研究領域課題番号】19H00975 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / イオンポンプ / カルシウムポンプ / ナトリウムポンプ / 膜蛋白質 / 能動輸送 / 結晶解析

【研究成果の概要】

本研究は、P型ATPase（ポンプ）による能動輸送機構を原子構造に基づいて解明し、究極的には「何故そういう構造が必要なのか」「構造変化を起こす（或いは妨げる）機構はどのようなものか」を理解することを目指している。
最も研究が進んでいる筋小胞体Ca2+ポンプに関しては、特に生理的濃度のCa2+存在下低pHでの結晶構造の解析を進めた。これまでに得られたE1・2Ca2+状態の構造は高濃度（10-100 ｍM）のCa2+存在下で得られたものであり、生理的条件とは著しく異なっていた。また、低pHで安定化されるE2・nH+状態にCa2+が結合したときはH+が結合したままである可能性もあった。得られた構造では、2個のCa2+の配位そのものは高濃度Ca2+存在下の構造と同一であったが、Aドメインは本体から外れており、そのままでは次のステップに行けないことがわかった。すなわち、「自己燐酸化におけるAドメインの役割は何か」「Aドメインが正しい位置にないと何故自己燐酸化は起きえないか」を解明する必要がある。
Na+ポンプに関しては、E1・3Na+状態の構造決定に加え、種々の強心ステロイドとの複合体の結晶構造解析研究の完成に注力した。強心ステロイドは2世紀以上にわたって心不全に対し処方されてきたが、Na+ポンプの強力阻害剤でもあり、使いにくいものであった。そのため、組織特異的な薬剤の開発が待たれていたが、本研究により重要な指針を与えることができた。さらに、予想外であったが、bufalinを結合させた結晶をRb+を含む溶液に浸漬することにより、1個のK+と1個のMg2+を結合した状態を作り得ることが判明し、2個のK+の順序だった結合過程と強心ステロイドによる阻害メカニズムを明らかにすることができた。以上の結果をPNAS誌に報告した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】45,760千円 (直接経費: 35,200千円、間接経費: 10,560千円)

【研究領域課題番号】18K06148 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Na+,K+-ATPase / イオン能動輸送 / 膜蛋白質 / X線結晶構造解析 / 能動輸送 / イオン選択性 / 電子顕微鏡単粒子解析 / 脂質二重膜 / Na+ポンプ / イオン選択機構 / 量子化学計算

【研究成果の概要】

Na+,K+-ATPaseは全ての動物細胞の細胞膜に局在し、ATP 1分子の加水分解エネルギーを利用して3個のNa+を細胞外へ、2個のK+を細胞内へ濃度勾配に逆らって輸送する膜蛋白質である。Na+の選択的輸送の理解に向けてNa+を結合した直後の状態、すなわちE1・3Na+状態の構造解析を行った。また、E1・3Na+状態の結晶を用いて、E1・Mn2+状態の構造、ATPアナログと結合したE1・3Na+状態およびE1.Mn2+状態の構造も明らかにした。これらの構造解析から、Na+ポンプはNa+を結合した時のみ燐酸化状態に進める、言わば安全装置のような仕掛けがあることが明らかになった。

【研究の社会的意義】

Na+,K+-ATPaseは生体内ATPの60%以上を消費するとも言われ、それによって形成されるイオン濃度勾配は様々な生命活動の基盤を成している。Na+,K+-ATPaseの異常は神経変性など多くの疾患の原因となるだけでなく、癌などに対する薬剤標的としてもNa+,K+-ATPaseは有用であることが多く示されている。したがって、その能動輸送の詳細な理解は学術的にも産業的にも重要である。本研究はなぜ、Na+だけを選択的に輸送できるのか、その仕組みを原子レベルで明らかにした。その巧妙な仕組みは学術的に興味深いだけでなく、遺伝性疾患におけるNa+,K+-ATPaseの異常の理解にも役立つものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】11308026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目標は筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造をまずは、既に薄いながらもX線レベルの三次元結晶が得られていたカルシウム結合状態(ElCa^<2+>)の結晶を用いて、原子分解能で決定し、さらに他の生理的状態に関しても結晶化を進めることであった。本研究は我々の期待を上回る速度で進行し、3つの状態について原子モデルを構築でき、さらに他の2つのカルシウム結合状態(E1ATPとE1Pのアナログ)についても結晶化に成功している。この結果、カルシウムと燐酸の離脱に伴う構造変化を明らかにすることが出来た。すなわち、カルシウムの離脱に伴い10本ある膜貫通ヘリックスのうち、6本が大きな再配置を起こし、カルシウム結合時には大きく離れていた三つの細胞質ドメインはコンパクトに集合することが判明した。膜貫通ヘリックスのうち2本は、膜に対し垂直方向の運動成分を持ち、カルシウムの離脱・結合に伴って、ピストンのように運動すること、すなわちP型イオンポンプは原子サイズの手押しポンプのような機構を持っていることが明らかとなった。その成果の一部は2000年6月と2002年8月にNatureに、2002年12月にPNASに発表することが出来た。
以上の成果は世界的注目を集め、NatureやNature Structure BiologyのNew ＆ Views、ScienceのEditor's choiceで詳しく紹介された他、世界標準の生化学、分子生物学の教科書に最近の大きな成果として紹介されている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】31,110千円 (直接経費: 30,600千円、間接経費: 510千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】10044198 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 大量発現 / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目的はP型イオンポンプによる能動輸送のメカニズムを構造面から理解しようとするものであった。計画立案時には、結晶が小さく、電子顕微鏡による解析しか不可能であったが、X線結晶解析に適用しうる三次元結晶の作製に成功したため、将来の発展を考え、部位特異的変異体の構造解析のための準備に重点を置くことにした。そのため、アデノウイルスによる発現系を用いてカルシウムATPaseの大量生産に成功している、米国メリーランド大学イネシ教授との共同研究を中心に据えた。カルシウムATPaseは分子量11万の膜蛋白質であるため、同教授グループしか構造解析に必要な量の産生に成功しているグループはないからである。この目的のために、代表者が一度渡米、イネシ教授側が3度来日して、研究の打ち合わせを行った。特に問題となったのは、培養細胞からの抽出精製方法である。イネシ教授側の最初の来日時に、代表者が結晶化の為に改良してきた精製法を収得して貰い、培養細胞系に適用した。その結果、従来の色素カラムによる精製方法では、純度の点で不十分であることが判明したため、改良を検討している。また、カルシウム存在下の構造に関し高分解能でのX線結晶解析がほぼ終了したため、その結果をイネシ教授側が行ってきた、カルシウム結合に関与した部位特異的変異体を用いた実験結果の解釈に利用することが出来た。これらの実験は相補的であり、大変有意義な成果をもたらした。この結果は共同の論文として、現在投稿中である。また、この過程で、共同で総説を書くことが出来た(印刷中)。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】4,700千円 (直接経費: 4,700千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】09480171 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イオンポンプ / 筋小胞体 / 能動輸送 / 三次元構造 / 電子顕微鏡 / 構造解析 / 膜蛋白質 / X線結晶解析

【研究成果の概要】

本研究では能動輸送の構造的基盤を解明するために、P型イオンポンプを代表する筋小胞体カルシウムATPaseを対象として、電子線・X線構造解析を行った。この膜蛋白質は本研究を開始した時点で、電子線で解析可能な2つの形態の結晶を作ることが知られていた。すなわち、カルシウムイオン非存在下小胞体膜そのものが変形してつくるチューブ状結晶と高濃度カルシウムイオン存在下で再構成膜がつくる三次元微結晶である。チューブ状結晶に関してはさらにATPの非加水分解アナログである。クロミウムATPを結合した状態でもチューブ状結晶をつくることを見出し、米国グループとの共同研究になる阻害剤thapsigarginを結合した状態とあわせるこの状態の構造を8A分解能で解析した。これによって膜内の二次構造やATPの結合部位が明らかになり、結果の一部分はNature,Biophys J に報告した。また、そのために広範なプログラムを開発した(投稿準備中)。一方、高濃度カルシウム存在下の三次元結晶の膜と平行な2回回転軸(b軸)方向の投影像を得、チューブ状結晶からの三次元構造と比較したところ、分子全体で大きな構造変化があることが判った(Biophys J に発表)。さらに、結晶化条件を改良した結果、薄いながらも良質の板状三次元結晶を得ることに成功した。ごく薄いものは電子線で、厚いものはX線で解析できることがわかった。電子線用の回転カメラと解析ソフトウェアを開発した結果、格子定数は電子線用のごく薄いものもX線結晶解析に用いたものとほぼ同一であることがわかった。そこで電子顕微鏡像による位相の収集に取り組み、部分的ではあるが大変有用な位相情報が得られた。現在、重原子同型置換体の探索を行っている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】13,800千円 (直接経費: 13,800千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】08044195 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イオンポンプ / カルシウムポンプ / 能動輸送 / 三次元構造 / 電子顕微鏡 / 構造解析 / 膜蛋白質

【研究成果の概要】

本研究は、イオンポンプの輸送サイクルの幾つかの状態での三次元構造を電子線構造解析によって可視化する事により、イオンの能動輸送の構造的実体を明らかにしようとするものである。対象とした筋小胞体カルシウムATPaseは、筋肉の弛緩時にカルシウムイオンを汲み出すポンプである。能動輸送の実体の解明には生理的に異なった状態の構造を解明することが必須であるが、本研究では特に、カルシウムが存在しない時にできるチューブ状結晶の高分解能解析と高カルシウム濃度でできる三次元結晶の構造解析に重点をおいた。チューブ状結晶に関しては、高分解能化のためのソフトウェアを代表者側が開発し、CrATPを結合させたもの、thapsigarginの結合部位を結合させたものについて解析を行った。この結果、ATP結合位置の同定(Biophys.J.発表済み)と8Å分解能での解析に成功した。thapsigargin存在下のものに関しては、10本の膜貫通へリックスが解像できており、イオン通路と思われる孔もみえる(Nature印刷中)。これは、日本側のソフトウェアと米国側の新鋭電子顕微鏡とが組合わさって得られた結果である。この目的のために、日本側が2度、米国側が1度渡航した。三次元微結晶に関しては、まだ手法的にも未確立であり、とりあえず7Å分解能で構造を解くことが目標である。そのために、代表者と分担者(小川)が渡米し、具体的な方針について討論した。また、膜面に平行に見た像が9Å分解能で得られ、カルシウム非存在下の構造とは大きく異なっていることもわかった。これも、共同研究の成果としてまとめ、投稿中である。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】5,300千円 (直接経費: 5,300千円)