【研究分野】基礎獣医学・基礎畜産学

【研究領域課題番号】24380161 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

繁殖生物学 / プロラクチン / 選択的スプライシング / シグナル伝達 / 性周期 / 獣医学 / 生理学 / 畜産学 / 遺伝学 / 受容体 / 乳腺 / 遺伝子

【研究成果の概要】

成熟雌ラットの性周期各時期に卵巣を摘出し、プロラクチン受容体ロングフォーム、ショートフォームについてリアルタイムPCRおよびウェスタンブロットを行ったところ、黄体退行の始まる時期である発情休止期の午後に、ロングフォームとショートフォームの発現比率がRNA・タンパクレベルで逆転した。そこでロングフォームの発現のみを抑制するスプライシング切替オリゴマーを持続的に投与し、血中性ステロイド濃度の測定を行ったところ、薬剤用量依存的に発情休止期の延長がみられた。以上より、ロングフォームが黄体の機能、および寿命の決定に中心的な関わりをもつことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】18,330千円 (直接経費: 14,100千円、間接経費: 4,230千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】04454105 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

乳腺 / レセプター / プロラクチン / インシュリン / MAPキナーゼ / 細胞増殖 / 成長因子 / 分化 / 乳腺上皮 / ホルモン / P34^<cdc2>キナーゼ / P32^<cdk2>キナーゼ / 分裂調節 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

インシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子は細胞培養系では乳腺上皮細胞の増殖にとって必須である。プロラクチンとプロゲステロンはこれと協同して増殖を促進する。インシュリン、IGF-I、EGFはシグナル伝達過程において、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、増殖の盛んでない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、そのいずれの時期にもMAPキナーゼが存在し、レセプターからのシグナルが伝えられると活性化される状態にある。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することは試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより特異的に増殖が刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により変化が見られず、また、酵素活性にも変化はなく、プロラクチンのシグナル伝達にはMAPキナーゼが関与していない可能性がある。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されることが知られているので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。また、乳腺は周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】03454096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロラクチン / プロラクチンレセプター / 細胞膜レセプター / 乳腺 / ホルモン依存性解離 / 負の相互作用 / スカッチャードプロット / ヒルプロット / レセプタ- / 解離機構 / 高濃度プロラクチン

【研究成果の概要】

本年度は研究の最終年度である。二年間において以下の研究を行ない、新らしい成果を明らかにした。大別して二方向から研究を行なった。
従来から、プロラクチンレセプターは、細胞膜のみならず、細胞内にも多量に存在することが知られていた。著者は、アッセー終了時に細胞を酸で処理することにより識別出来ると考え、その条件を明らかにした。その結果、プロラクチンは細胞内に自由に取り込まれること、細胞内に存在するレセプターと結合した。しかし、このプラクチンは、酸処理に強い抵抗性に示した。一方、細胞膜に結合したプロラクチンは、酸処理により容易に解隣した。レセプターの存在する場所により異なった性質を示した。又、それぞれは、異なった変動を示し、独立に制御されていた。新らしい研究の分野がひらかれた。次に、高濃度プロラクチンの生理作用を、反応速度の面から明らかにした。プロラクチン濃度が異常に高くなると、解離速度が速くなる。もし相互作用が無ければこのような現像は起こらない。そこでスカッチャード及びヒルプロットにより解析を行なった。いずれの結果も高濃度プロラクチンは、相互作用の存在を示した。プロラクチンが解離したレセプターは、本来の性質を保ったことから、高濃度プロラクチンの存在下では、レセプターが飽和するのでなく、むしろ結合反応の頻度が著しく増加する、ことを示している。このような現像は他のホルモンにおいても認められ、同様な機構であると予測することが出来る。一般にこれらのホルモンが異常に高くなると体の異常を引き起す。その機序を開明出来た。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1991 - 1992

【配分額】4,800千円 (直接経費: 4,800千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】01480090 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞培養 / 乳腺 / コラ-ゲンゲル / 乳蛋白質 / 遺伝子 / カゼイン / プロラクチン / レセプタ- / 乳腺上皮 / カゼイン分泌 / αカゼイン / βカゼイン / 抗カゼイン抗体 / プロラクチンレセプタ- / カゼインcDNA

【研究成果の概要】

多数のホルモンの作用によって多種類の蛋白質を合成する乳腺の遺伝子発現系を解明するためには、無血清細胞培養系を確立するとともに、その蛋白質産物をアッセイする系を構築すること、また、乳蛋白質をコ-ドする遺伝子の転写を調べるためのプロ-プをクロ-ニングし、さらに、一ー乳蛋白質の合成を指令するプロラクチンの情報を細胞内に伝達する機構を解明するため、レセプタ-の性質を研究することが不可欠である。この目的にそって行われた本研究で、以下の成果を得た。
1. 浮遊コラ-ゲンゲンル細胞培養法によってマウス乳腺を培養し、培養液中に乳蛋白質を合成・分泌させ、カゼインをウェスタ-ンブロットにより検出した。さらに、マウスのαおよびΒカゼインをそれぞれ認識するもノクコ-ナル抗体を作った。この実験系を用いて、乳腺を最終分化させるためのホルモンはインシュリン+グルココルチコイド+プロラクチンであることが確認した。ビタミンDの分化誘導作用を検討したが、ビタミンDはグルココルチコイドにかわることができない。
2. 乳蛋白質の遺伝子のうち、ΒカゼインのcDNAおよびゲノムDNAはすでにクロ-ニングされており、酸性乳清蛋白質のcDNAもクロ-ニングされている。本研究では、αカゼインのcDNAのクロ-ニングを試みており、いくつかのクロ-ンを得ており、現在、塩基配列を分析中である。そのほかに、分子量4ー5万の乳蛋白質をコ-トするcDNAの断片とそのゲノムのDNAをクロ-ニングした。まだ、完全な同定は終わっていない。
3. 兎乳腺のプロラクチンレセプタ-を認識するモノクロ-ナル抗体を作り、これを用いて乳腺のレセプタ-を解析した。乳腺のプロラクチンレセプタ-には分子量8万と4万の2種類が存在する。ペプチドマッピングの結果、分子量4万のレセプタ-は分子量8万のレセプタ-の一部であることが明らかとなった。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1989 - 1990

【配分額】6,800千円 (直接経費: 6,800千円)