Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

D-アミノ酸 / D-アラニン / D-アスパラギン酸 / アラニンラセマーゼ / アスパラギン酸ラセマーゼ / 無脊椎動物 / 等浸透調節 / 神経系 / 脱皮

無脊椎動物に広く分布する遊離D-アミノ酸が独自の機能を担って構築する「D-アミノ酸バイオシステム」の、無脊椎動物における普遍性を明らかにするため以下の検討を行った。
1.クルマエビの筋肉および肝膵臓からすでに得られたアラニンラセマーゼ(ARase)のcDNAを大腸菌から発現させ,精製後その性質を調べた。また,新たなcDNA塩基配列を取得し比較した。このcDNAは翻訳領域の5'上流に欠損があり、その機能に興味がもたれた。
2.クルマエビARaseの塩基配列を基に、筋肉部に多量のD-アラニンをもつミルクイ中腸腺からARaseのcDNAクローニングを行った。演繹アミノ酸配列はクルマエビのそれと32%のアミノ酸同一率しか示さず、細菌類のそれとわずかな差しかなかった。翻訳領域全長をベクターに組み込み、大腸菌から発現タンパクを得て、活性を確認した。
3.D-アラニンをもたず、D-アスパラギン酸を含有するアカガイ、サトウガイ足筋および各種頭足類についてアスパラギン酸ラセマーゼ(DRase)活性を比較し、スルメイカ視神経節からDRaseのcDNAクローンを得た。演繹アミノ酸配列はアカガイ足筋のそれと48%のアミノ酸同一率であったが、哺乳類脳のセリンラセマーゼと40%弱、また細菌のスレオニンデヒドラターゼ類とも同程度の相同性を示し、細菌のDRaseとは全く相同性を示さなかった。これらはすべてピリドキサールリン酸依存性であり、したがってこれら酵素の分子進化を明らかにする上で、きわめて有益な結果が得られた。
4.環形動物ゴカイ・イソメ類についてD-アラニンおよびARaseの分布を調べ、ゴカイ類にのみ存在することを確認した。アオゴカイを15〜41pptの海水に順応させたところ、体壁のD-,L-アラニンのみが高浸透海水中で大きく増加し、等浸透調節のための最も有効なオスモライトであることが確認された。現在ARaseのcDNAクローニングを行っている。
以上の検討結果から、甲殻類、軟体類、多毛類においては「D-アミノ酸バイオシステム」が普遍的に機能していることが明らかになった。

遊離D-アミノ酸 / D-アラニン / アラニンラセマーゼ / D-アミノ酸オキシダーゼ / D-アスパラギン酸オキシダーゼ / 細胞内等浸透調節 / 無脊椎動物 / 魚類

甲殻類および数種二枚貝組織に多量に存在するD-アラニン(Ala)の生理機能を解明するため、アラニンラセマーゼの(ARase)一次構造解析を行った。クルマエビ筋肉および肝膵臓から421残基のアミノ酸コード領域を含む1,798bpの塩基配列を決定し、細菌と酵母以外では初めてARaseの一次構造を明らかにした。
コイ肝膵臓からD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)のcDNAクローニングを行い、347残基のアミノ酸をコードする1,041bpのORFを含む1,294bpのクローンを得た。このcDNAの全翻訳領域をベクターに組み込み、大腸菌で発現を試み、可溶性の組換え体DAOを高い活性で得た。精製された組換え体DAOはVmax、Kmおよびkcat/Km値から見て、D-Alaに対して最もよく作用することを確認し、またその他の詳細な酵素学的性質を明らかにした。
コイにD-Alaを含む餌を投与し、諸組織中のDAO活性およびDAOのmRNAの発現を調べ、コイDAOが餌中のD-Alaに誘導されることを明らかにした。コイの肝膵臓では投与1日目からDAOのmRNAの発現が認められ、投与期間中上昇傾向を示した。これに伴ってDAO活性も上昇した。一方、コイにおけるmRNAの発現は腸管で最も強く、次いで肝膵臓および腎臓の順で、筋肉や脳では全く発現が認められなかった。以上のことから、コイにおけるDAOは単なる解毒酵素ではなく、D-アミノ酸の炭素骨格を回収するための重要な酵素であると考えられた。

【研究分担者】
岡田茂	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
吉川尚子	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助手	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
村上昌弘	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教授	(Kakenデータベース)
岡田茂	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助手	(Kakenデータベース)
渡部終五	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	教授	(Kakenデータベース)