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筋小胞体 / カルシウム / ATPase / 三次元構造解析 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 低温電子顕微鏡法 / カルシウムATPase / 三次元構造 / 構造変化 / 蛋白質結晶 / 画像解析

本研究では、カルシウムATPaseの異なった状態での三次元構造を、氷包理電子顕微鏡法によって解析し、能動輸送の構造的実体を明らかにすることを目標とした。まず、ATPとカルシウムがともに結合していない状態のチューブ状結晶から14A分解能で三次元構造を解析し、Natureに発表した。この結果、膜内構造は3つのセグメントからなるユニークなものであることが判り、アミノ酸配列から予想される二次構造ともかなりの対応がつけられた。さらに、加水分解されないATPのアナログであるクロミウムATPを結合させた状態の構造を、やはり14A分解能で解いた。両者のチューブ状結晶においてらせん対称性の同じものを選ぶことができたので、ATP非存在下のものと詳細な比較が可能であった。その結果、ATP結合部位と予想していたポケットが埋まり、そのすぐ上の領域が蓋のように動いたことが認められた。また、膜内のA、Bセグメント、内腔側にも明瞭な変化が認められ、ATPの結合による構造変化が内腔側まで伝わることが確かめられた。高濃度のカルシウイオン存在下で生成する三次元微結晶に関しては、10Aを越える分解能で、膜に沿った方向の像を得た。以上の研究によって、次の段階である時間分解構造解析の基礎を作ることができた。
一方、チューブ状結晶の歪みを補正するための一連のプログラムは、一応実用になる段階に達し、カルシウムATPaseのチューブ状結晶にも適用したところ、回折パターンの著しい改善が認められた。従って、個々のらせんを可視化できる可能性は非常に高くなった。

三次元構造解析 / 膜蛋白質 / カルシウムATPase / 筋小胞体 / 低温電子顕微鏡法 / 氷包埋法 / 蛋白質結晶

本研究では,筋小胞体のカルシウムポンプである,カルシウムATPaseの三次元構造を,自然な脂質二重膜に埋まったままの状態で,氷包埋低温電子顕微鏡法を用いて,14Å分解能で求めた。(現在は,結晶化条件の検討によって,11Å分解能の顕微鏡像も得られている。)三次元像は,チュ-ブ状結晶のらせん対称性を利用し,本研究で改良したプログラムを用いて得た。らせんのパラメ-タはチュ-ブごとに異っていたが,私が開発した手法により,系統的指数付けを行い,3種の独立した平均デ-タを得た。得られた構造は,分解能の違いによる差はあるが,基本的に同一であった。これは,高等動物の膜蛋白質の3次元構造としては,現在得られている最も詳細なものである。最大の成果は,この分子の膜内の構造が初めて明らかになり,一次構造との対応もある程度つけられたことである。上記の分解能では個々のαらせんは解像できないが,膜内は,細胞質側とつながった主要部の他に,2つの細い(1〜2本の膜貫通らせんから成ると考えられる)部分から成っていた。そのうちの一つは膜に対して著しく傾斜しており,主要部と小胞体内側で結びつけられていた。アミノ酸配列からは一本だけ異常に長い膜貫通らせんの存在が予想されており,このらせんと主要部との間にのみ,比較的長いペプチド鎖の存在が予想されていた。従って,得られた三次元構造は,構造予測のモデルと非常に良く一致するものであった。この長い傾いたらせんと機能の関係は現在のところ解っていない。
一方,プログラムの開発も続けられており,格子の歪みを補正する新しいプログラムの開発を行った。