Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

超高圧電子顕微鏡 / 電子線トモグラフィー / インスリンシグナル / 心筋微細構造 / APEX2 / インスリン抵抗性 / ミトコンドリア / 筋小胞体 / 糖尿病性心筋症 / 電子顕微鏡

（１）超高圧顕微鏡による電子線トモグラフィー技術を用いた心筋組織の3次元微細構造解析技術を開発
これまで心筋の微細構造は透過電子顕微鏡（TEM）を用いて解析されてきた。TEM 法は、非常に高い分解能が得られるものの、電子線が透過できる厚さが0.1μm以下という制限が存在するため、マイクロメートルのスケールで三次元構造解析を行うことは困難であった。超高圧顕微鏡を用いることで、0.3μm, 0.5μm, 0.8μmの厚さのマウス心筋試料もZ帯、I-band、A-band、M-band、ミトコンドリア、T管-筋小胞体構造が、３次元構築に耐えうる解像度で描出できることが確認され、実際に心筋Z-bandの3次元構築画像も作成し、今までにない厚みの立体画像の構築に成功している。また、厚みのある心筋試料の観察は当初予想していた３次元観察の幅を広げるのみでなく、従来の電子顕微鏡では捉えられなかった構造の発見にもつながっており、今後の新規構造体の機能解析も計画する。

（２）APEX（アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）による生体心筋細胞内分子の標識および電子顕微鏡観察技術の構築
心臓のインスリンシグナルの時空間制御機構を解析するために、インスリンシグナル分子のAKT1およびAKT2と電子顕微鏡用標識蛋白であるAPEX2との融合蛋白を心筋特異的に発現した遺伝子改変動物を作成した。心筋でのAKT１およびAKT2の心筋での局在を、（１）で開発した電子線トモグラフィー技術を用いてナノメートルレベルの解像度で撮影する技術を開発中である。

イオンポンプ / 筋小胞体 / 能動輸送 / 三次元構造 / 電子顕微鏡 / 構造解析 / 膜蛋白質 / X線結晶解析

本研究では能動輸送の構造的基盤を解明するために、P型イオンポンプを代表する筋小胞体カルシウムATPaseを対象として、電子線・X線構造解析を行った。この膜蛋白質は本研究を開始した時点で、電子線で解析可能な2つの形態の結晶を作ることが知られていた。すなわち、カルシウムイオン非存在下小胞体膜そのものが変形してつくるチューブ状結晶と高濃度カルシウムイオン存在下で再構成膜がつくる三次元微結晶である。チューブ状結晶に関してはさらにATPの非加水分解アナログである。クロミウムATPを結合した状態でもチューブ状結晶をつくることを見出し、米国グループとの共同研究になる阻害剤thapsigarginを結合した状態とあわせるこの状態の構造を8A分解能で解析した。これによって膜内の二次構造やATPの結合部位が明らかになり、結果の一部分はNature,Biophys J に報告した。また、そのために広範なプログラムを開発した(投稿準備中)。一方、高濃度カルシウム存在下の三次元結晶の膜と平行な2回回転軸(b軸)方向の投影像を得、チューブ状結晶からの三次元構造と比較したところ、分子全体で大きな構造変化があることが判った(Biophys J に発表)。さらに、結晶化条件を改良した結果、薄いながらも良質の板状三次元結晶を得ることに成功した。ごく薄いものは電子線で、厚いものはX線で解析できることがわかった。電子線用の回転カメラと解析ソフトウェアを開発した結果、格子定数は電子線用のごく薄いものもX線結晶解析に用いたものとほぼ同一であることがわかった。そこで電子顕微鏡像による位相の収集に取り組み、部分的ではあるが大変有用な位相情報が得られた。現在、重原子同型置換体の探索を行っている。