【研究分野】育種学

【研究領域課題番号】09556002 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アセトアルデヒド脱水素酵素 / イネ / 呼吸 / 低酸素 / アルデヒド脱水素酵素 / 稔性回復遺伝子 / 核ゲノム / AOX / ミトコンドリアゲノム

【研究成果の概要】

作物の稔性はエネルギーの供給に頼っており、エネルギーは主にATPとして酸素呼吸から得られる。ミトコンドリアで働く呼吸系遺伝子は核とミトコンドリアゲノムに支配され、両者のクロストークがエネルギー産生を左右し、稔性を制御すると思われる。そこでイネにおいて核とミトコンドリアに支配される呼吸系遺伝子の酸素に対する影響を調ぺた。冠水状態のような低酸素条件にイネを置くとalternative oxidase遺伝子(AOX1a)を含む核コードである呼吸系遺伝子の転写産物の蓄積は低下したが、ミトコンドリアコードの遺伝子では変わらなかった。ルテニュウムレッドはミトコンドリアなどのオルガネラのカルシュウムイオン排出の阻害剤である。低酸素状態でこのルテニュウムレッドを投与すると投与しないコントロールに比ぺて、AOX1a遺伝子は発現の減少があまりなかったが、チトクローム呼吸経路に関与する遺伝子の転写産物の蓄積は変化しなかった。アセトアルデヒド脱水素酵素(ALDH)は低酸素条件下で発現量が上昇するか、ルテニュウムレッドを投与しても、この上昇には変化がなかった。なおルテニュウムレッドとカルシュウムイオンを同時に加えた場合はどちらも加えないコントロールと同じ結果になることから、この実験において、ルテニュウムレッドはカルシュウムイオン排出の阻害剤として働いていることがわかる。以上の結果は、AOX1a遺伝子の発現制御にはカルシュウムイオンか関与しているが、それ以外の遺伝子には関与しておらず、低酸素状態のミトコンドリアから核への情報伝達には少なくても2種類あることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】14,200千円 (直接経費: 14,200千円)

【研究分野】育種学

【研究領域課題番号】06556002 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イネ / ミトコンドリアゲノム / 形質転換 / プラスミド様DNA / アンチマイシン / エディティング

【研究成果の概要】

ミトコンドリアは生物エネルギーの変換を行う重要な器官で、これの効率化はすべての作物に重要である。ミトコンドリアの機能は遺伝的には核とミトコンドリアゲノムの二元的支配を受けている。このうち、母性遺伝を行い交雑で改良できないミトコンドリアゲノムは遺伝子導入法がなく、その開発が待たれている。
本研究はミトコンドリアのプラスミド様DNAがミトコンドリア内で安定的に増殖することに着目し、これを改変して形質転換のためのプラスミドを構築した。選択マーカーにはアンチマイシン耐性に変異させたcob遺伝子を用いることにし、同遺伝子のエディティングを調べた。プラスミドの構築には、pBSKS+プラスミドを土台にミトコンドリアで発現するatplのプロモータにアンチマイシン抵抗性になるように43番のGlyをValにまたは234番のLysをIleに人工的に改変したcob遺伝子を付け、さらにatp6の3'非翻訳領域をつないだ。最終的にはミトコンドリア内で安定的に増殖させるために、さらにプラスミド様DNA(B4)を挿入して形質転換用プラスミドとした。
一方Particle gunによる形質転換系を確立するため、CaMVの35SプロモータにGUSをつないだ形質転換用プラスミドを構築し、Particle gunを用いてイネ培養細胞に導入し、一過性のGUS活性が発現されるのを確認した。これによりParticle gunによる一般的な形質転換系は確立した。ついで上記ミトコンドリア形質転換用プラスミドをParticle gunを用いてイネカルスに導入することを試みたが、現在のところ成功していない。
このためプラスミド様DNAの複製に関する解析、atpl遺伝子をはじめとする遺伝子発現の解析などを行い、その結果による形質転換用プラスミドを構築し、再度試みる予定である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1994 - 1996

【配分額】14,600千円 (直接経費: 14,600千円)

【研究分野】育種学

【研究領域課題番号】05404007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イネ / ミトコンドリアゲノム / 転写制御 / 転写開始点 / 転写地図 / 反復配列 / PRS

【研究成果の概要】

ミトコンドリアは呼吸を通して、貯蔵エネルギーを生物が利用しやすいATPに変換する。しかし高等植物のミトコンドリアゲノムは構造が複雑で、ゲノムの分子構造と機能の関係が余り解明されておらず、育種へ応用が限定されている。本研究ではイネのミトコンドリアゲノム全体の遺伝子の位置を特定し、転写を調べ、それから遺伝子発現の制御因子についても解明し、その改変による育種への応用の基礎データを得ることをめざした。
ミトコンドリアゲノム全体の転写領域を特定し、詳しく解析しゲノムの物理地図上に位置を示した。その過程で、ABC型ヘム輸送タンパク質の遺伝子であるhelC(orf240)とNADH脱水素酵素のサブユニット6の遺伝子であるnad6をtrnN遺伝子の近傍に新たに見つけ、遺伝子の塩基配列を決定した。
次に転写単位の転写開始点を、in vitro キャッピング法とRNaseプロテクション法で調べた。その結果、イネにおいてもCRTAがミトコンドリアのプロモーターの中心配列であることが明らかになった。さらにミトコンドリアゲノムにおける遺伝子発現を解析した結果は、その機構は非常に柔軟であることを示している。たとえば、trnfM遺伝子はrrn26の上流から複製された76塩基の共通配列をプロモーターにして転写される。また葉緑体から転移したtrnHの転写にミトコンドリア特異配列がプロモーターとして働いたり、葉緑体転移配列がミトコンドリア固有の遺伝子であるnad9を発現させていたことも明らかになっている。これらはゲノムの構造変異に対応して遺伝子発現も柔軟になっていることを示している。ミトコンドリアはエネルギーの消費器官であり、その活動は必要最小限に限られるべきである。これらの機構は微妙な発現制御を可能にし、移動の自由がない植物が種々の環境かで生き延びるための戦略であると思われる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1993 - 1996

【配分額】33,500千円 (直接経費: 33,500千円)