【研究領域課題番号】20K15892 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シナプス / 超解像顕微鏡 / 神経科学 / 細胞生物学 / イメージング / 超解像技術

【研究成果の概要】

記憶や学習といった脳機能には、シナプスが新たに作られ、外部からの刺激によって可塑的に変化し、また数年以上もの長期にわたって維持されることが必要である。シナプスが変化する過程で、スパインの頭部体積の増減やシナプス小胞の増減に関連して軸索末端の形態変化が起こる。またスパイン頭部や軸索末端から微細な突起が伸びだす様子も知られており、両者が接触を介して複雑な情報交換をしていることが示唆される。シナプスとその近傍で起こる複雑な細胞間相互作用を明らかにし、その機能的な意義を生体で検証することは、記憶や学習といった脳機能を理解する上で重要な問題である。
本研究では、シナプスの可塑性と安定性に関わる分子メカニズムの解明を目指し、興奮性シナプスを構成する樹状突起スパインと軸索末端を従来の光学顕微鏡の限界を超えた分解能で同時にタイムラプス観察する基盤技術の確立を目的とする。さらに、より生体内に近い状態でのシナプスの形態と動態を高い分解能で観察することを目指す。これらにより、記憶・学習の細胞生物学的な構造基盤の理解を進める。
昨年度までに培養神経細胞のスパインと軸索末端を同時に高分解能で観察する基盤技術が確立されたので、令和3年度は生きた動物においてシナプス可塑性が起きたシナプスをナノスケールで形態情報を取得するための技術基盤の構築を優先的に進めた。新たに膨張顕微鏡法を導入し、この技術とこれまで開発を進めたスパインの三次元形態解析技術との組み合わせを行った。膨張顕微鏡法を用いることで、これまでより厚みのある標本でスパインの形態解析を実施することが可能になった。次に海馬錐体神経細胞を標識する遺伝子導入技術、アデノ随伴ウイルスによる標識または子宮内電気穿孔法による標識をそれぞれ試し、海馬CA1-CA3領域の錐体細胞を疎に標識する条件を見出し、膨張顕微鏡法によるスパイン形態解析を実施した。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2020-04-01 - 2024-03-31

【配分額】3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)

【研究分野】神経解剖学・神経病理学

【研究領域課題番号】26250014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シナプス / イメージング / 超解像顕微鏡 / 自閉症モデル動物

【研究成果の概要】

シナプス動態を先端的なイメージング技術を活用して解明することを目的として、大脳皮質における興奮性、抑制性シナプス形態の解析、二光子顕微鏡によるシナプス成熟過程の解析、超解像顕微鏡によるシナプス構造の解析、精神神経疾患モデル動物のイメージング解析を行った。これらの実験により、生後発達早期の神経回路発達過程におけるシナプス動態には回路特異的な制御機構が存在すること、シナプス動態が生後発達過程で障害される事によって、神経回路の機能不全が生じることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】39,780千円 (直接経費: 30,600千円、間接経費: 9,180千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】26830043 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Ca2+シグナル / シナプス可塑性 / シナプス / シグナル伝達 / 神経科学 / 生化学 / イメージング / Ca2+シグナリング / 蛍光プローブ / 顕微鏡 / 分子生物学

【研究成果の概要】

脳機能を理解するためには、複雑な脳の中での神経活動とそれによって活性化される生化学反応を計測し、演算を理解する必要がある。神経細胞での生化学演算を計測するために、本研究では非常にダイナミックレンジを改善した新型のCa2+依存的酵素に対するプローブを開発した。そして、これらのプローブを用いて、Ca2+依存的リン酸化酵素(CaMKII)と脱リン酸化酵素(カルシニューリン)の活性化の時空間的プロファイルを生きた神経細胞の樹状突起およびシナプスにおいて計測し、全く異なることが明らかになった。この成果は、神経細胞における生化学演算機構の一端を明らかにし、高次脳機能の理解につながるものと考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】神経生理学・神経科学一般

【研究領域課題番号】25221001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大脳皮質 / 視覚野 / 高次視覚野 / 領野間相互作用 / ２光子イメージング / カルシウムイメージング / 軸索イメージング / シナプス / 領野 / 相互作用 / イメージング / 大脳 / 情報分配 / 並列処理 / 軸索 / 方位選択性 / 空間周波数 / 2光子イメージング

【研究成果の概要】

大脳皮質における情報処理は、多数の領野の相互作用により行われている。このような領野間相互作用の全体像と、それを担う神経回路をシナプスレベルで解明するため、(1)広域イメージング法を開発し、マウス全脳の機能マッピングを行い、高次視覚野の機能分担を明らかにした。さらに、(2)全脳の神経活動と血流変化を同時に計測する方法を開発し、fMRIで臨床研究にも応用されている安静時の機能的結合が、確固たる神経基盤を持つことを明らかにした。(3)最後に、シナプスレベルで領野間を伝わる情報を可視化する方法を開発し、視床から一次視覚野へ、一次視覚野から高次視覚野へ、どのような情報が伝わっているのかを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2013-05-31 - 2018-03-31

【配分額】125,710千円 (直接経費: 96,700千円、間接経費: 29,010千円)

【研究分野】薬理学一般

【研究領域課題番号】24590313 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シナプス / グルタミン酸 / イメージング / 蛍光イメージング / グルタミン酸イメージング

【研究成果の概要】

神経回路での神経伝達物質の放出機構を理解には個々のシナプスでのグルタミン酸の放出ダイナミクスの精密な計測が必要である。本研究では脳標本における神経細胞のシナプスから放出された神経伝達物質グルタミン酸の高精細な蛍光イメージング技術の確立を目的とする。本研究では高性能グルタミン酸蛍光プローブの開発と神経細胞に選択的にグルタミン酸プローブを標識する技術の開発を行った。開発したグルタミン酸プローブをボツリヌス毒素の非毒性領域やHaloTag技術を採用することで神経細胞に選択的に標識することで、大脳皮質標本において放出されたグルタミン酸をシナプスレベルの解像度で可視化解析することに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】神経・筋肉生理学

【研究領域課題番号】23800019 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経科学 / 脳・神経 / 神経 / ニューロン / シナプス / スパイン / 樹状突起 / 回路 / イメージング / カルシウム

【研究成果の概要】

新規に開発した大規模スパインイメージング法を用いて、海馬ニューロンの樹状突起におけるシナプス入力の時空間パターンを観察することに成功した。興奮性ニューロンにおいては近傍のスパインが同時に活動していたことから、同期入力が樹状突起の局所に集約されていることが見いだされた。一方で、Parvalbumin陽性の抑制性ニューロンにおいては同期入力が分散型であることを見いだし、ニューロン種特異的なシナプス入力の空間制御が存在することを明らかにした。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2011

【配分額】1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】神経解剖学・神経病理学

【研究領域課題番号】21240032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シナプス / イメージング / PSD / スパイン / GFP

【研究成果の概要】

本研究では新しい光学的測定技術であるStochastic Optical Reconstruction(STORM)法をシナプス後部の分子に適用することで、シナプス内部における分子分布を直接的に可視化することを試みる。この目的の為に、シナプス後肥厚部(PSD)の骨格をつくる蛋白質であるPSD-95に光スイッチとなる分子(Dronpa,EosFP,Dendraなど)を結合した分子プローブを作成し、神経細胞に発現させてSTORM法による可視化が可能であるかどうかを検討した。
更に組織内でのシナプスを同様にSTORM法で観察するための技術開発として、水溶性の樹脂に脳組織を包埋し、厚さ1ミクロン程度の切片を作成してSTORM法を適用することを試みた。
現時点では予備的な実験であるが、組織内の分子プローブの蛍光強度を維持したまま、厚さ2ミクロン程度の切片を作成し、蛍光観察することが可能となった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2009

【配分額】20,020千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 4,620千円)

【研究分野】神経解剖学・神経病理学

【研究領域課題番号】21220008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分子神経生物学 / シナプス後肥厚部 / 超解像顕微鏡 / 二光子顕微鏡 / シナプス可塑性 / シナプス / イメージング / ＧＦＰ / 高解像度 / ＰＳＤ / GFP / PSD

【研究成果の概要】

PALM（あるいはSTORM）法は一分子蛍光の検出を利用した高解像度光学顕微鏡法である。一個のシナプス後肥厚部（PSD）は直径500nm 以下の微細なディスク状構造であり、PALM 法によりその内部構造を捉えることが可能である。本研究では、蛍光蛋白質で標識されたPSDおよびスパインについて、PALM 法を用いてその内部の分子分布を検出した。更にシナプスの発達の過程とシナプス可塑性が起こった後のPSD内の分子分布の変化を同定することに成功した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2009-05-11 - 2014-03-31

【配分額】142,350千円 (直接経費: 109,500千円、間接経費: 32,850千円)

【研究分野】薬理学一般

【研究領域課題番号】19890094 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

グルタミン酸 / イメージング / シナプス

【研究成果の概要】

計画の1年目として、神経伝達物質であるグルタミン酸を可視化するための蛍光性のグルタミン酸可視化プローブ(EOS)の改良を行った。EOSはAMPA型グルタミン酸受容体のGluR2サブユニットのグルタミン酸結合ドメインを基本骨格として利用して、その403番目アミノ酸残基のセリンをシステインに置換し、そのシステインのチオール基に選択的に蛍光色素オレゴングリーンを結合させたものである。EOSを用いて、標本中のどこのシナプスがどの程度のグルタミン酸を放出しているのかを高精細に解析することを可能にし、ホルボールエステル等の薬物処理を行うことで生じるシナプスの可塑的変化を単一シナプスレベルの分解能で経時的に捉える事ができた。以上のグルタミン酸可視化プローブの開発からそのシナプス伝達可視化への応用の成果をまとめ、論文として発表した(Namiki S, Sakamoto H, Iinuma S, Iino M, Hirose K. European Journal of Neuroscience,25,2249)。EOSを用いてより高精細なグルタミン酸イメージングを実現する為に、従来型EOSにアミノ酸変異を加えることで、従来型と比べ約50%のダイナミックレンジの向上が実現した。これにより従来型では困難であった単一シナプスレベルでのグルタミン酸放出を培養海馬神経細胞において、優れたS/N比で検出することに成功した。また、高次構造データや過去の報告を基にグルタミン酸結合に寄与していると予想されるEOS中のアミノ酸残基に変異を導入しグルタミン酸との親和性の調節を試みた。これによりnMオーダーからmMオーダーの解離定数を有する複数のグルタミン酸プローブのラインナップの整備ができた。

【研究種目】若手研究(スタートアップ)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,075千円 (直接経費: 2,670千円、間接経費: 405千円)