【研究領域課題番号】21K18232 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ナノポア / １分子 / タンパク質翻訳 / リボソーム / 膜タンパク質

【研究成果の概要】

本研究は無細胞翻訳系によるリボソームの翻訳とナノポアによるペプチドの解析を融合させ、リボソームから出てきた新生ペプチドが直接ナノポアを通過することによって、合成されたタンパク質の網羅解析を行う基盤技術の開発を行います。
まず、ナノポアシステムの正確な構築テストのため、膜タンパク質ナノポアではなく、すでに実績のある半導体ナノポア計測によって生体分子を1分子レベルで計測できるシステムを構築しました。窒化シリコン半導体基板をレーザーでエッチングしながら電圧を印加させることで、数nmの孔を開けることに成功しました。
次にこの孔でtRNA分子の通過計測を行い、転写後修飾なしのtRNAと修飾ありのtRNAを比較することで修飾なしのtRNAに比べて、修飾ありのtRNA構造安定性が向上した結果を得ました。また、H2Aヌクレオソームをナノポアで計測することで、DNAがヒストンから引き剥がされてナノポアを通過する様子が観察されました。さらにH2A.Bヌクレオソームバリアントと比較することで、バリアントはDNAの引き剥がされる過程が多様であることがわかりました。
このように半導体ナノポアによって核酸分子や核酸タンパク質複合体の構造安定性を計測することができるようになりました。この計測結果は新規に計測されたものであり、分子動力学シミュレーションで再現されるかを現在テストしています。
次に、膜タンパク質ナノポアの構築を進めました。液滴接触法を用いて脂質二重膜を再構成することによって、αヘモリシン膜タンパク質ナノポアを構築し、DNA分子の通過を計測することに成功しました。今後はSecYEGにおいて同様に膜タンパク質ナノポアを構築できるかを試し、さらにリボソームとの複合体形成を試し、新生ペプチドの検出へと研究開発を進めていきます。

【研究種目】挑戦的研究(開拓)

【研究期間】2021-07-09 - 2024-03-31

【配分額】26,000千円 (直接経費: 20,000千円、間接経費: 6,000千円)

【研究分野】ケミカルバイオロジー

【研究領域課題番号】17H00888 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜タンパク質 / リポソーム / 進化分子工学 / 人工細胞 / 無細胞タンパク質合成系 / デノボデザイン / 人工膜タンパク質 / バイオテクノロジー / リポソームディスプレイ法 / 無細胞翻訳系 / 合理的設計 / 生物物理

【研究成果の概要】

自然界が進化によって探索した配列空間はほんの一部である。合理的デザインにより、現在までに可溶性タンパク質については、未開拓配列空間に多くの構造・機能を持つ人工タンパク質が存在することが明らかになってきた。本研究では、膜タンパク質でも機能・構造を持つ人工膜タンパク質を持つ分子が存在すること示した。具体的には、2 nmのポアを持つ人工膜タンパク質を設計し、その機能を人工細胞リアクターを用いて明らかにした。

【研究の社会的意義】

人工細胞を構築する研究は、非生命から生命をどのように創り出せるかを明らかにする方法の一つである。現在までに、細胞の機能を模倣した様々な人工細胞が構築されてきた。本研究課題では、人工細胞が人工膜タンパク質の機能解析に用いること、更には、膜タンパク質進化分子工学に使えることを示すものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】43,160千円 (直接経費: 33,200千円、間接経費: 9,960千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】26650044 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

合成生物学 / 人工細胞 / 膜タンパク質 / ゲノム / 無細胞転写翻訳 / 細胞再構成 / 細胞内環境 / リポソーム / 大腸菌 / 再構成

【研究成果の概要】

本研究では人工細胞を生細胞に近づけその性質を解析することで、生命を構成するために必要な条件を明らかにするための基盤を構築することを目的とした。この試みを通し、細胞分裂面を決定するタンパク質局在波の人工細胞内における起動条件を見出した。また、生細胞と同様に多種多様の膜タンパク質を保持した人工細胞の構築を目的とした新規人工細胞融合法の開発と、ゲノムDNAを無細胞系によって機能的に転写翻訳する系の確立、ゲノムを転写する人工細胞の構築を行った。本研究で開発された手法や得られた知見は、生細胞のように振る舞う人工細胞を創成するための重要な基盤となることが期待される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】26660082 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バクテリオロドプシン / ＡＴＰ合成酵素 / 光合成 / ATP合成酵素 / リポソーム / PURE system / 膜蛋白質

【研究成果の概要】

バクテリオロドプシンとFoF1-ATP合成酵素を組み込んだ（BR-FoF1）リポソームベースのバイオナノリアクターの構築が研究目的である。PURE systemによりFoF1-ATP合成酵素の全サブユニットをリポソーム上に発現させた。特に、各サブユニットの合成量が等しくなるように、ＤＮＡ量の条件検討を行った。合成されたATP合成酵素が十分な活性を有していることを見いだした。バクテリオロドプシンについては、レチナールのスペクトルからナノディスク上には活性を有した形で挿入されていることが示された。さらに、変異型と天然型のバクテリオロドプシンをリポソームディスプレイ法による選抜が可能であった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】26630426 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リポソーム / ナノファイバー / 膜タンパク質 / ナノバイオ / バイオテクノロジー / 蛋白質

【研究成果の概要】

本研究の目的は、Acinetobacter sp. Tol 5細胞上の接着性ナノファイバータンパク質AtaAをリポソーム内部で合成し、表面に生やすことである。我々は、AtaAの基本構造を損なわずに正しくフォールディングされる縮小版ataAの遺伝子を作成し、無細胞タンパク質合成系でのポリペプチド鎖の合成を確認した。次に、縮小ataA遺伝子を細胞サイズのジャイアント・シングルラメラ・リポソーム内部で発現させ、縮小版AtaAタンパク質の合成とリポソーム表層提示を試みた。フローサイトメトリ－により、抗体蛍光標識した縮小版AtaAが極微量提示されている可能性が示されたが、確実と言えるレベルではなかった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】ケミカルバイオロジー

【研究領域課題番号】25282239 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

進化分子工学 / 無細胞翻訳系 / 膜タンパク質 / リポソーム / 膜蛋白質

【研究成果の概要】

本研究では、in vitroで膜タンパク質をスクリーニング可能な技術であるリポソームディスプレイ法を確立し、これを利用した膜タンパク質の機能進化を行うことを目的とした。大腸菌由来の多剤排出トランスポーターEmrEをモデル膜タンパク質として用い、これの２つの機能である輸送活性と膜挿入活性を指標に機能進化が行える技術を確立した。次にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーから野生型EmrEよりも基質輸送活性の高い遺伝子プールを取得した。また、リポソームディスプレイ法に膜タンパク質輸送装置であるトランスロコンを導入することで、ディスプレイ可能な膜タンパク質のレパートリーの拡張に成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23247013 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / 無細胞蛋白質合成系 / リポソーム / シャペロン / ＡＴＰ合成酵素 / トランスロコン / 膜タンパク質 / 自己組織化 / 生体外蛋白質合成系 / 膜蛋白質複合体 / フォールディング / 膜蛋白質 / 蛋白質複合体 / ATPase / トランスコロン / 膜透過機構

【研究成果の概要】

多くの蛋白質は複合体を形成することで制御された機能発現が可能となるが、細胞内の複合体の形成プロセスはほとんど未解明である。本プロジェクトでは、再構築型無細胞蛋白質合成系PURE systemを用いて、ポリペプチドの合成反応と複合体形成を試験管内で再構築を行った。その結果、細胞膜上の２２のポリペプチドから形成されるATP合成酵素、および３つのポリペプチドからなるトランスロコンの合成に成功した。また16SrRNAと20種類の蛋白質からなる超分子複合体であるリボソームの小サブユニット（３０Ｓ）の効率の高い再構築を、さまざまな生合成因子の共存により成功した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2011-04-01 - 2014-03-31

【配分額】48,360千円 (直接経費: 37,200千円、間接経費: 11,160千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】22580082 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微生物代謝 / ABCトランスポーター / 膜タンパク質 / 輸送体タンパク / チオシアネート / 硫化カルボニル / リポソーム / 共発現 / 蛋白質異種発現系

【研究成果の概要】

ABC型膜輸送体のそれぞれのコンポーネントと相同性を持っている、チオシアネート加水分解酵素下流にコードされる4種類の遺伝子配列の翻訳産物について、実際に活性を持った輸送体として得られるかどうかを大腸菌と酵母を宿主とする組換え発現系を用いて検討した。細胞質内ヌクレオチド結合ドメインにあたる遺伝子産物は大腸菌・酵母いずれにおいても高効率に発現したのに比べ、細胞外ドメイン、細胞膜ドメインの遺伝子産物はごく微量な発現にとどまった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】マイクロ・ナノデバイス

【研究領域課題番号】18310092 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

マイクロ流体デバイス / 膜タンパク質 / 網羅的解析 / MEMS / Lab on a Chip / 脂質二重膜 / 膜タンパク質チップ / 脂質2重膜 / リポソーム

【研究成果の概要】

18年度はまず、我々が考案した接触法を利用して、様々直径めリポソームが形成できることをした。まず、膜タンパク質の導入された脂質2重膜にガラス管などのマイクロノズルを近づけ、ジェット流をパルス的に発射する。このジェット流のパルス幅(時間)および、膜とノズルの距離、ノズル直径など、さまざまなパラメータを調整し、直径をある程度制御可能な条件を明らかにすることができた。ジェット流の発射の際に、主要なべシクルのほか、小さいベシクルもできるサテライト現象が起きることも分かった。これらを積極的に利用することによって、より小さいベシクルを作成できることもわかってきた。
また、膜作成において、平面膜の作成法に関しても研究した。微細加工を利用して、マイクロサイズの微小孔を作成し、内部に脂質2重膜を作成する。孔の形成には、高分子フィルムであるパリレン樹脂を利用した。その結果、複数の孔に安定して2重膜が再構成できることが分かった。これらの結果の一部は18年度の化学とマイクロシステム国際会議(microTAS2006)にて発表し、好評を得た。
続いて19年度は、、実用化に向けて大量にベシクルを作製するために、安定した平面膜アレイの構築を目指した。接触法を応用し、3x3の平面膜を電気的に絶縁した状態で形成することに成功した。さらにそこヘチャンネル電流を発生するペプチドや膜タンパク質を導入し、活性が維持されることを電気的に計測した。また、多チャンネルでの同時計測にも成功した。
これらの研究成果によって、多チャンネル同時計測が可能な膜タンパク質チップの創製へ大きく近づいたと考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】17,290千円 (直接経費: 15,700千円、間接経費: 1,590千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】18201040 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

無細胞蛋白質合成系 / リボソーム / シャペロン / フォールディング / 分泌蛋白質 / 膜蛋白質 / 生体外蛋白質合成系 / フォールデング / GroEL / 翻訳後修飾 / トリッガーファクター

【研究成果の概要】

蛋白質の成熟過程のメカニズム解明することを目標として、再構築した蛋白質合成系PURE systemによって大腸菌ゲノム上の全蛋白質(4132個)の合成を行い、各蛋白質の凝集特性を遠心分離により可溶性を評価した。PURE systemにより合成可能また電気泳動可能であった7割についての評価したところ、凝集しやすさは二峰性を示すことが示された。分子量が小さい蛋白質、等電点が低い蛋白質は可溶性が高いことが示された。また、細胞質の凝集傾向のある蛋白質792個について、シャペロン存在下のPURE systemで合成を行い、その可溶性の向上から、シャペロン依存性を評価した。以上の解析結果をe-Solデータベースとして公開した(http://tp-esol.genes.nig.ac.jp/)。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】51,740千円 (直接経費: 39,800千円、間接経費: 11,940千円)

【研究分野】高分子物性・高分子材料

【研究領域課題番号】02453099 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜タンパク質 / リポソーム / 人工境界脂質 / リポソームワクチン / 癌 / 赤血球 / リポソ-ム / リポソ-ムワクチン / 膜タンパク再構成リポソ-ム / 人工ワクチン

【研究成果の概要】

近年のタンパク質化学の目覚ましい進展に伴い、タンパク質群の構造および機能解析は著しく進んだ。しかし、その殆んどは可溶性タンパク質についてであり、細胞膜タンパク質に関しては非常に遅れているのが現状である。本研究では、リポソームと生細胞を混合すると、細胞表層の膜タンパク質がリポソーム側に温和な条件下に転移してくることに着目し、この手法を細胞膜タンパク質の機能解明に巾広く利用する目的で種々の検討を行なった。具体的には、実際の細胞膜中での膜タンパク質の存在様式を調べ、膜タンパク質の周囲に存在する境界脂質(boundarylipid)の重要性を考慮し、人工境界脂質(DDPC)を分子設計・合成した。まず、種々のDDPC含有DMPCおよび卵黄レシチンリポソームとヒト赤血球とを相互作用させ、細胞からリポソーム側へ転移してくる膜タンパク質量とリポソーム組成との相関を調べた。その結果、DDPCを添加することにより、タンパク質の転移効率が有意に増大すること、さらにリポソーム中のDDPCの添加量を変える事で、転移してくるタンパク質の種類を制御しえる事も明らかになってきた。また、赤血球膜中の膜酵素の一種であるアセチルコリンエステラーゼが、その活性を90%以上保持したまま、リポソームに再構成されることもわかった。次に、癌細胞(放射線誘導癌細胞・Balb RVD)から抗原提示タンパク質を直接リポソームに移行、再構成させリポソームワクチンを作成し、マウスを使った実験で高い抗腫瘍効果の発現に成功した。この手法は、従来法と比較して抗原性タンパク質の化学的変性も起こらず、より高い免疫能が得られることも実証しており、新しいワクチン調製法として今後おおいに展開が予想される。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1990 - 1991

【配分額】6,200千円 (直接経費: 6,200千円)