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本研究では培養系において単離小脳プルキンエ細胞に対するシナプス形成過程のリアルタイム分析を目指している。第1段階として、マウス・プルキンエ細胞の単離培養系の開発を行い、さらに培養プルキンエ細胞の発達過程を分析した。小脳ニューロンに最適化した無血清培地(Furuya et al.,1998)を用い、さらに播種密度などの諸条件を系統的に検討した結果、従来難しかったマウス胎児由来単離小脳プルキンエ細胞の長期(1ヶ月以上)培養が可能となった。また、この方法により培養したプルキンエ細胞では樹状突起形態や電気的興奮特性の発達が生体内での生後発達と良く似た時間推移で進行し、所期の実験遂行に適当であることが分かった。第2段階として、上記の培養系に下オリーブ核ニューロンをの共培養する技術を開発した。2〜3日前に準備しておいた小脳ニューロン培養系の上に妊娠16日齢マウス胎児由来の下オリーブ核スライスを貼付することにより、登上線維を数百ミクロンにわたって出芽・伸展させることに成功した。また共培養開始直前にgene gunを用いて蛍光色素DiIを付着させた金属微粒子を下オリーブ・スライスに打ち込む技術も開発した。この技術により、生きたままの状態で登上線維を効率良く標識できるようになった。さらにDiI標識像をレーザー共焦点顕微鏡で5〜10分毎に観察することにより、登上線維の伸展の様子を24時間以上にわたりリアルタイムで観察することに成功した。現在、第3段階として、GFP遺伝子を導入し自家蛍光を発するようにしたプルキンエ細胞を単離培養系の材料として用い、DiI標識登上線維のGFP標識プルキンエ細胞に対する神経支配過程のリアルタイム分析を進めている。なお、培養法に関する成果はJournal of Neuroscience Methods (Tabata et al.,104:45-53,2000)に発表した。また、培養法の応用に関する論文をProc.Natl.Acad.Sci.USA.
(Furuya et al.,97:11528-11533,2000)に発表し、Journal of Neuroscienceにも投稿中である。

【研究分担者】
田端俊英	金沢大学	医学部	助手	(Kakenデータベース)