【研究領域課題番号】21K18233 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / 翻訳合成 / ペプチド医薬 / アミノキシ酸 / ヒドラジノ酸 / ペプチドミメティック / tRNA / 翻訳 / ペプチド創薬

【研究成果の概要】

ペプチド医薬品の実用化の促進に向けて、ペプチダーゼ耐性の低さや膜透過性の低さといった課題を克服する必要がある。そのためには、天然のアミド結合以外の結合様式により連結されたペプチドミメティック主鎖骨格の導入により機能を改善することが有効である。そこで、本研究ではリボソーム翻訳によりアミド結合以外の主鎖骨格を持つペプチドミメティック化合物群の合成を目指す。
リボソーム翻訳でペプチドミメティック化合物を合成する利点は、鋳型となるmRNAの配列を変えるだけで多様な配列のペプチドミメティック化合物を合成できることにある。mRNAの配列をランダマイズすれば、ランダムペプチドミメティック・ライブラリの構築も迅速かつ容易に可能である。このライブラリをmRNAディスプレイ法と組み合わせることで、標的となるタンパク質等に特異的に結合し阻害するペプチドミメティック群を容易にスクリーニングでき、新規ペプチドミメティック医薬品へと展開できる。
本年度は、3種類のα-ヒドラジノ酸および6種類のα-アミノキシ酸を3'末端にチャージした人工tRNA（Pro1E2）を用いて、ヒドラジノアミド結合およびオキシアミド結合を連続で導入することを実現した。Pro1E2はDアーム部分にEF-P認識配列を導入した人工tRNAであり、翻訳系にEF-Pを加えることでヒドラジノアミド結合およびオキシアミド結合の形成を促進できることを明らかにした。これにより、D-ヒドラジノプロリンのペプチド鎖中への10連続での導入、α-アミノキシ酢酸の7連続での導入に成功した。本手法によって合成されたα-ヒドラジノ酸およびα-アミノキシ酸を含むペプチドミメティック群は、今後新規ペプチド医薬品開発のプラットフォームとして期待できる。

【研究種目】挑戦的研究(開拓)

【研究期間】2021-07-09 - 2024-03-31

【配分額】25,870千円 (直接経費: 19,900千円、間接経費: 5,970千円)

【研究領域課題番号】21K06208 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / 転写 / mRNA分解 / small RNA / uORF / リボソーム / 5'非翻訳領域 / ホウ素

【研究成果の概要】

本研究ではホウ素濃度に応答した、シロイヌナズナのホウ素輸送体、NIP5:1の翻訳制御を介したmRNA分解による転写制御のフィードバック機構を明らかにすることを目的とし、翻訳、mRNA分解、転写の３つの解析を行い、その全体像を明らかにすることにした。1)NIP5;1のmRNA分解を介した転写制御機構の解析：NIP5;1のmRNA分解産物からsRNAが形成され、それがNIP5;1の転写を負に制御しているかをsRNA生成に関わる遺伝子、RDR及びsRNAと結合し、転写を制御する因子、AGO1の変異株を用いて、pre-mRNA解析から、NIP5;1の転写を調べた。結果、野生型では高ホウ素条件によるNIP5;1の転写抑制が見られたが、変異株では高ホウ素条件による転写抑制が見られなかった。このことから、mRNA分解産物から生成されたsRNAがAGO1と結合し、NIP5;1の転写を抑制している可能性が強く示唆された。　2)AUG-UAA上でのリボソーム停滞により誘導される未知エンドヌクレアーゼの解析：これまで、逆遺伝学的解析から、NIP5;1のホウ素依存的な発現制御に関わる遺伝子の特定を行ってきた結果、mRNA分解に関わる遺伝子がみつかった。この遺伝子はRNAの分解酵素ドメインを保存しており、この変異株では高ホウ素条件下でのNIP5;1mRNA蓄積の抑制が弱まる。この遺伝子は細胞質に局在していた。この分解ドメインに変異を導入した株では、NIP5;1のmRNAの蓄積のホウ素応答性が野生型に比べて弱まり、分解ドメインはRNA分解活性を持っていた。このことからNIP5;1のmRNA分解に関わる遺伝子であると推察される。3)NIP5;1のホウ素依存的な翻訳制御に関わる因子の同定：逆遺伝学的解析から、翻訳に関わる遺伝子がみつかった。相補実験を行い、この遺伝子が原因遺伝子であることを確認した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】20K05954 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

tRNA / 翻訳 / タンパク質合成 / 遺伝暗号解読 / コドン / リボソーム

【研究成果の概要】

前年度では翻訳中ペプチジルtRNAの抽出法を確立させたが、レポーター遺伝子のテストコドンを解読したペプチジルtRNAのみを精製する方法を確立することができなかった。そのため、今年度は一部方針を変更し、各アミノ酸のコドンを1種類に限定したレポーター遺伝子を大腸菌細胞内または無細胞翻訳系で発現させ、抽出したペプチジルtRNAのtRNA部分を配列解析することによってアイソデコーダーの使用頻度を算出する方法の確立に取り組んだ。レポーター遺伝子は３種類設計した。また、前年度に課題となったペプチジルtRNA以外のtRNAの非特異的な混入を解決する方法として、選択的デアシル化とデアシルtRNAの3’末端処理を組み合わせることによってペプチジルtRNAのみをアダプターにライゲーションする方法を試行錯誤し、最終的にその確立に成功した。これらの方法を用いて、上記のレポーター遺伝子を大腸菌細胞または無細胞翻訳系によってそれぞれ発現させ、ペプチジルtRNAを抽出し、ＮＧＳ解析によって各tRNAの定量解析を行った。この時、tRNAプール中の各tRNAの存在量比を測定するため、未処理の全tRNA画分についても定量解析を行っている。その結果、無細胞翻訳系では、特定のアイソデコーダーtRNAにしか読まれないコドンを有したレポーター遺伝子ではそれぞれ対応するtRNAの相対量が顕著に高く検出されたことから、実験系が機能していることが証明できた。また、複数種のアイソデコーダーtRNAによって読まれるコドンについては、アイソデコーダーtRNAの使用頻度はtRNAプール中の存在比とは異なり、コドン種によって特徴があることが分かってきた。一方、大腸菌細胞のデータではそのような差が見られなかった。これはレポーター遺伝子の発現量が内在遺伝子の発現量を凌駕できずそれら由来のペプチジルtRNAによるものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】19K06481 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / ユビキチン化 / 品質管理 / 翻訳

【研究成果の概要】

本研究では、異常な翻訳停滞を識別する分子機構、ならびにその後の終止コドン非依存型サブユニット解離機構の解明を目指して研究を進めてきた。
その結果、翻訳停滞からユビキチン化を介したサブユニット解離までの多段階反応を試験管内で再現することに成功した。得られた結果では、翻訳停滞によって衝突したリボソーム特異的にuS10のユビキチン化が観察され、さらに、ユビキチン化されたTrisome 構造体(3つのリボソームからなる構造体)が、RQT複合体の作用によって特異的にサブユニット解離することが明らかになった。

【研究の社会的意義】

タンパク質の合成途中のエラーによる翻訳停止はタンパク質の機能の重大な欠陥を引き起こし、タンパク質の恒常性の破綻につながります。タンパク質の恒常性の破綻は、更に不良なタンパク質の蓄積やオルガネラの損傷、シグナル伝達経路の撹乱など、広範な細胞機能の障害を引き起こすため、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患の原因になると考えられています。本研究では、細胞の持つ品質管理の仕組みを分子レベルで解明しました。本成果は、神経変性疾患の原因となる異常タンパク質の合成を効率的に抑制する治療薬の開発に貢献する事が期待されます。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】18K06054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / 哺乳類ミトコンドリア / リボソーム / 新生ペプチド鎖 / ミトコンドリア / タンパク質合成 / ペプチドトンネル / cryoEM

【研究成果の概要】

本研究は、ミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの構造を明らかにし、新生ペプチド鎖とペプチドトンネルの相互作用について知見を得ることを目指すものである。哺乳類ミトコンドリア翻訳系を再構築し、連続プロリン配列を介した翻訳停止を利用して新生ペプチド鎖リボソーム複合体(ribosome-nascentchain complex, RNC)を形成することに成功した(Lee, 2021)。新生ペプチド鎖の長さについて検討したところ、新生ペプチド鎖の長さが約80アミノ酸以上でそのN末端がミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの外に露出することが明らかになった。

【研究の社会的意義】

近年、ミトコンドリアのリボソームや翻訳因子に誤作用して副作用をもたらす薬剤が多く報告されている。また、リボソームのペプチドトンネルは、新生ペプチド鎖のプロセシングや折りたたみ、細胞内輸送などの制御をになう場であり、ペプチドトンネルは多くの抗生物質の結合部位となっている。本研究により、新生ペプチド鎖の配列や長さを制御しながらミトコンドリアのRNCを調製することが可能になった。今後様々なRNCの構造を決定することにより、薬剤デザイン等に有用な知見が得られると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究領域課題番号】18H02080 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプチド医薬 / 翻訳 / tRNA / リボソーム / 非天然アミノ酸 / 翻訳合成 / ペプチド創薬

【研究成果の概要】

本研究ではリボソーム翻訳によりD-アミノ酸やβ-アミノ酸、γ-アミノ酸、N-メチルアミノ酸等の非天然アミノ酸をペプチド鎖中に効率よく導入する手法の開発を行った。さらに、この手法を活用してこれらの非天然アミノ酸を含む大環状ペプチドライブラリを構築し、mRNAデイスプレイ法により様々な疾患原因タンパク質に結合する阻害剤ペプチドの取得に成功した。得られたペプチド群は非常に強い結合力・阻害活性を示した上、高い血中安定性を持つことが明らかになった。

【研究の社会的意義】

D-アミノ酸やβ-アミノ酸、γ-アミノ酸、N-メチルアミノ酸等の非天然アミノ酸はペプチドの安定性や標的への結合力、細胞膜透過性等の特性を向上させることができる。これらの非天然アミノ酸を含む特殊ペプチドの翻訳合成法を確立できれば、鋳型mRNAの配列を変えるだけで容易にランダム特殊ペプチドライブラリを構築することが可能になる。さらに、mRNAディスプレイ法などの配列スクリーニング手法を適用することで、薬理活性を持つ特殊ペプチドを効率的に探索できるため、非常に有効なペプチド創薬プラットフォームとなる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】16H06152 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / リボソーム / 履歴 / 選択的スプライシング / mRNA / 相互作用解析 / 発現制御 / 構成的生物学 / バイオテクノロジー / トランスレイトーム

【研究成果の概要】

真核生物のもっとも基本的なモデル生物である出芽酵母を用いて、タンパク質合成装置であるリボソームを細胞内で標識し、標識されたリボソームを生理条件下で抽出するための技術基盤を構築した。また、細胞内で同じ配列の違う分子を見分けるための方法や、間接的あるいは一過的なmRNA とタンパク質の相互作用を解析するための方法につながるシード技術を開発した。さらに、予期せずして新奇な翻訳開始現象を見出した。

【研究の社会的意義】

生命現象の根源とも言える「タンパク質合成反応」に従来とは異なる視点から挑むことを通じて生命の不思議に対してより深い理解をもたらすと期待される。長期的には、「転写量からタンパク質合成量の精密な予測」を実現し、発生・分化の仕組みや病因・病態の解明など生命科学のあらゆる分野において、生命現象を動的なシステムとして理解すること、さらにその挙動を計算機上で再現することに貢献すると期待される。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】27,430千円 (直接経費: 21,100千円、間接経費: 6,330千円)

【研究分野】神経生理学・神経科学一般

【研究領域課題番号】15K14311 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / 翻訳 / リボソーム / 神経 / 形態 / レポーター / GFP

【研究成果の概要】

本研究においては、神経の可塑性に関連すると考えられている細胞内タンパク質合成活性の変動を直接捉えることができるレポータータンパク質の開発を行った。測定時のシグナル強度がタンパク質合成を直接反映するように、タンパク質合成中のみに蛍光を発し、合成後に自己消化して消光するような人工レポータータンパク質を設計し、実際に自己消化機構が働くことを確認した。自己消化の効率を上げるためにリンカーの長さや、プロテアーゼ断片の配置や、蛍光タンパク質への変異導入などを行い、最適化を行った。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】26840001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

translation / termination / ribosome / mRNA分解 / 翻訳終結

【研究成果の概要】

真核細胞は遺伝情報の維持・発現の過程で生じる異常mRNAを認識・分解する仕組み「mRNA品質管理機構」を備えている。本研究では、高等真核細胞における翻訳終結コドンを欠失したノンストップmRNAの分解機構解明を目的とした。その結果、ノンストップmRNA分解経路がショウジョウバエ細胞にも保存されていること、また、ABCE1（リボソーム解離因子）が関与していることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】25660053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / tRNA / リボソーム / 遺伝子発現

【研究成果の概要】

バクテリア翻訳系では、翻訳伸長初期段階において、合成中のペプチドがtRNAに結合した状態でリボソームから脱離する現象（drop off）が恒常的に起きている。既存の実験手法ではペプチジルtRNAのペプチド部分を同定することが難しく、そのメカニズムは未だ明らかになっていない。本研究では、質量分析法によってrRNA変異体やtRNA修飾変異体の細胞内ペプチジルtRNAを定性的・定量的に解析を行い、drop offに関わるrRNAやtRNA分子の構造的要素を特定した。その結果、これまで知られていなかったRNA分子の機能を見出すことができ、翻訳過程について新たな知見を提示できたと考えている。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】25291003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / 疾患モデル / ゼブラフィッシュ / 造血異常 / 核小体 / 発がん / 飜訳 / ダイアモンド・ブラックファン貧血 / ダイヤモンド・ブラックファン貧血 / 翻訳

【研究成果の概要】

リボソームの異常に起因する疾患「リボソーム病」は、リボソームによる選択的なmRNAの翻訳調節機構が破綻した結果であると考え、これを検証するためにゼブラフィッシュで疾患モデルを作製し、系統的な解析を実施した。その結果、リボソームタンパク質RPS19に変異があるダイアモンド・ブラックファン貧血のモデルでは、造血に関与する遺伝子や糖鎖の合成に関わる遺伝子の翻訳効率が低下した。また、rRNAの修飾を阻害したモデルでは、RNA修飾が初期発生に必須であり、多くの遺伝子の翻訳が変動した。本研究により、リボソームの選択的な翻訳調節機構がリボソーム病の発症に大きく関わることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)

【研究分野】ケミカルバイオロジー

【研究領域課題番号】13F03730 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプチド / ケミカルバイオロジー / キモカイン / トランスポーター / 遺伝記号 / 特殊ペプチド / tRNAアルシ化 / 翻訳 / アミノ酸 / リボソーム

【研究成果の概要】

CXCR7を標的とした特殊環状ペプチドの探索
CXCR7はGPCRファミリー膜タンパク質の一つであり、炎症誘導因子キモカインの一つであるCXCL12を受容タンパク質として知られている。また、この受容体はHIVに代表されるウィルス感染において重要な標的タンパク質としても知られている。Geielmann博士は、磁気ビーズに固定化したCXCR7に対し、特殊環状ペプチドライブラリーを用いたRaPIDセレクションを行い、結果として12種類の特殊ペプチドを発見した。これら個々の特殊環状ペプチドクローンをRaPIDディスプレイで評価したところ、いずれもバックグラウンド（ビーズ単独）の数千倍の結合能力を示し、定性的ではあるがCXCR7に対して結合できる特殊環状ペプチドが発見できた証拠を得た。そこでこれらを全て化学合成し、共同研究先に送付、現在さらなる結合評価と生理活性評価、ならびに共結晶化を進めている。
(2) hTOM40を標的とした特殊環状ペプチドの探索
Geielmann博士は、磁気ビーズに固定化したhTOM40に対し、特殊環状ペプチドライブラリーを用いたRaPIDセレクションを行い、結果として多種類の特殊ペプチドを発見した。これらのうち、８種類の特殊環状ペプチドを選び、個々の特殊環状ペプチドクローンをRaPIDディスプレイで評価したところ、いずれもバックグラウンド（ビーズ単独）に対し優位な結合能力を示し、定性的ではあるがhTOM40に対して結合できる特殊環状ペプチドが発見できた証拠を得た。そこでこれらの特殊環状ペプチドを化学合成し、それぞれの解離定数をSPR-Biacoreを用いて解析した。その結果、130 nM～1000 nMのレンジで結合することがわかった。残念ながら、それほど高い親和性をもっているとは言い難い特殊環状ペプチドではあるが、これはら全て共同研究先に送付、フリブルグ大Schneider研で生理活性評価、ならびにバーゼル大Hiller研で共結晶化を進めている。

【研究種目】特別研究員奨励費

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】システムゲノム科学

【研究領域課題番号】24310148 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソームプロファイリング / ゲノム解析技術 / リボソーム / 翻訳 / 翻訳制御 / コドン / 抗生物質

【研究成果の概要】

遺伝子mRNAからタンパク質が翻訳される状況を新しい実験手法で解析し、ゲノム全体の遺伝子を見た場合、翻訳開始の構造が翻訳の効率に大きな影響を与えることを明らかにした。対して、翻訳伸長の効率にも差はあったが、遺伝子全体の翻訳効率に大きな影響は与えていなかった。
また、コドン-アンチコドンの３文字目の認識や、small RNA/Hfqによる翻訳制御の実体など、ネイティブな翻訳関連因子の性質についてや、様々な抗生物質の作用機序など、これまで知られていなかった性質を示す新たな知見を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】20,410千円 (直接経費: 15,700千円、間接経費: 4,710千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】23780102 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現 / 翻訳 / 翻訳精度維持機構 / tRNA / リボソーム / rRNA

【研究成果の概要】

細胞内の翻訳途中脱離ペプチジルtRNAを調べるために、RNA単離技術とLC/MS解析法を確立した。その結果、様々なペプチジルtRNAの同定に成功した。各pep-tRNAを単離し詳細に解析した結果、大腸菌遺伝子にはコードされていない配列をもつpep-tRNAが見つかった。このことは誤って生成されたpep-tRNAはペプチジル転移反応以降に新規の翻訳精度維持機構によって翻訳系から排除されるといったシステムの存在を示唆するものである。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】22370065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / リボソーム / 造血異常 / 発がん / ゼブラフィッシュ / 核小体 / p53 / リボソーム病 / 疾患モデル

【研究成果の概要】

リボソームはすべての生物に不可欠なタンパク質の合成工場である。最近、リボソームの異常が細胞のがん化や骨髄不全などの原因となる可能性が示された。本研究は、リボソームの異常に起因する「リボソーム病」発症の分子機構を解明することを目的とした。ゼブラフィッシュを用いた疾患モデルの解析により、リボソーム病発症に関わる重要な因子を同定した。また、研究推進に不可欠なデータベースの整備を行った。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010-04-01 - 2013-03-31

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】22370062 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

mRNA 品質管理 / 翻訳アレスト / 新生ポリペプチド鎖 / mRNA 分子内切断 / ユ ビキチン化 / プロテアソーム / リボソーム / リボソーム解離因子 / mRNA品質管理 / 異常RNA分解 / 異常タンパク質分解 / ユビキチン化 / RNA / 翻訳 / 品質管理 / タンパク質分解

【研究成果の概要】

新生ポリペプチド鎖依存の翻訳アレストに必須な因子として、RACK1を同定し、RACK1の40Sリボソームへの結合が翻訳アレストに重要性であることを示した。RACK1は、60Sリボソーマルサブユニットと結合するE3ユビキチンライゲースLtn1依存の新生ポリペプチド鎖の分解にもRACK1が必須である事を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】19370075 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現 / 品質管理 / 異常mRNA / 異常翻訳 / プロテアソーム / リボソーム / 新生ポリペプチド鎖 / 翻訳アレスト / RNA / 翻訳伸長阻 / RMA品質管理 / タンパク質分解 / mRNA分解 / 翻訳

【研究成果の概要】

我々は、代表的な異常mRNAであるノンストップ(終止コドンを持たない)mRNAにおける翻訳抑制と異常タンパク質分解機構について解析を行い、ポリ(A)鎖の翻訳自体が、多段階での発現抑制機構を作動させ、品質管理機構において必須な役割を果たすことを初めて明確に示した。翻訳アレストを引き起こすアミノ酸配列の特異性について解析を行った結果、塩基性新生ポリペプチド鎖の持つ正の電荷とリボソームトンネルを形成するリボソーマルRNAの負の電荷の間の静電的相互作用による翻訳抑制機構が示唆された。さらに、連続した塩基性アミノ酸配列に依存する翻訳アレストは、1)合成途中のポリペプチド鎖のプロテアソームによる迅速な分解と、2)mRNAの分子内切断を引き起こすことも明らかにしている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)