【研究分野】森林圏科学、水圏応用科学およびその関連分野

【研究領域課題番号】17K19282 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アコヤガイ / 真珠 / ゲノム編集 / 遺伝子導入 / バイオミネラル / Pinctada fucata / バイオミネラリゼーション / ゲノム改変 / トランスジェニック / 外套膜上皮細胞

【研究成果の概要】

代表的な真珠貝として知られるアコヤガイについて、真珠形成を行う細胞である外套膜上面上皮細胞のゲノムを人為的に改変する手法の確立を試みた。外套膜組織片やそこから分離した上面上皮細胞に対し、アコヤガイと異なる生物の遺伝子を導入をした結果、そうした外来遺伝子がアコヤガイの一部の細胞で発現することを確認した。また、任意の遺伝子に変異を誘導するゲノム編集技術であるCRISPR/Casを使い、アコヤガイのゲノム編集を試みた。これについては、ある一つの遺伝子について変異の導入を検出したが、検出過程でのエラーの可能性を排除できないため、さらに検証する必要がある。

【研究の社会的意義】

養殖真珠産生にも散られるアコヤガイは、産業上重要種であるが、バイオミネラル研究のモデルとしても長い歴史を持つ。本研究では、アコヤガイを対象に、遺伝子導入やゲノム編集によるゲノム改変を真珠形成組織である外套膜細胞に施し、一定の成果を得た。アコヤガイの真珠形成関連遺伝子は数多く見つかっているが、それらの機能は不明なものが多く、アコヤガイにおける遺伝子導入や改変技術は、そうした遺伝子の機能解析を行うための技術基盤として重要である。また、遺伝子改変を行った外套膜細胞を用いて、アコヤガイをバイオリアクターとした新規バイオミネラル作出技術の確立にもつながることが期待される。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2017-06-30 - 2019-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究分野】基礎獣医学・基礎畜産学

【研究領域課題番号】14360174 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Cre / Pseudo loxP / loxP / トランスジェニックマウス / DNA顕微注入 / 遺伝子導入 / トランスジェニック / マウス / loxp / Cre酵素 / Pseudoloxp / psedoloxp / CAG

【研究成果の概要】

生殖系列に遺伝子を導入する際に利用されるDNA顕微注入法は、DNAの注入が前核でのDNA複製の開始が後に行われた場合、生産されたTg個体にはしばしばモザイクとなる。もし、外来遺伝子を保有する細胞が生殖細胞に分化していないと、外来遺伝子は子孫へ伝達されないためTg動物は一代限りのモザイクTg動物となる。DNA顕微注入法を利用してモザイクTg動物が作出されないように外来遺伝子を宿主ゲノムのpseduolox部位に組み込ませるためには、前核期胚でDNA複製前に注入したCre遺伝子の発現があり、この酵素の作用により外来pseudoloxp部位をもつ遺伝子と宿主ゲノム内のpsedoloxp部位との間で組み換えが起こることである。そこで、1)前核に注入したCre発現ベクターと両側にpseudoloxp部位をもつLaxZプラスミドを前核に注入したところ、DNAの複製前にCre酵素の発現とpseudoloxp部位での組み換えが生じたことが確認された。2)前核期に注入したCre酵素が発現し、宿主ゲノム内に存在するpseddoxp部位を認識して組み換えを起こすかを検証した。CMV/loxP/CAT/loxP/LacZ遺伝子が導入されたTgマウス(大阪大学医学部宮崎純一教授より供与)を通常のマウスと交配して採取した受精卵にDNA顕微注入法によりCAG/Cre発現ベクターを注入し、体外で桑実胚あるいは胚盤胞まで発生させた結果、DNA複製前で組み換えに組み換えが起ることが判明し、さらに、内在loxp部位で高い頻度で組み換えの起ることを見い出した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】10356010 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

EGFP / 蛍光胚 / transgenic embryo / cre / loxP / 形質転換家畜 / 遺伝子導入 / 異種移植 / トランスジェニック / マウス胚 / マーカー遺伝子

【研究成果の概要】

1.EGFPをマーカーとしたTg胚の選別法について検討した。マウス受精卵前核にCMV/β-actin/EGFP遺伝子を顕微鏡注入し、体外培養後、桑実胚ないし胚盤胞期に蛍光顕微鏡で観察が、偽妊娠マウスへ移植した。生まれたマウスのDNA解析の結果、胚全体で蛍光を発する胚の移植から、76.9%、モザイク様蛍光胚の移植から21.6%のTgマウスが得らた。2、CAG/EGFP遺伝子にWAP/hGH遺伝子を連結した連結遺伝子を受精卵前核に顕微鏡注入し、同様な方法でTg胚を選別した後、仮親に移植した。生まれたマウスのDNAおよび緑色蛍光を調べた結果、生まれたマウスのうち約82%がTgマウスであった。また、血液ならびに乳汁中のhGHを測定したところ、それぞれ、hGHが検出され、EGFPを発現しているマウスの全てで、hGH遺伝子が発現していた。
3、Cre/loxp系を利用した遺伝子導入が試みられているが、この系を利用する場合には、creを発現するトラスジェニック(Tg)動物とloxp遺伝子を導入したTg動物の2系統のTg動物の作出が必要であり、家畜に利用するには難点がある。最近、酵母や細菌で見い出されたloxpと相同な配列を持つ偽(ψ)loxp部位がマウスのゲノムム内にも発見された。このcre/ψloxp系を利用し培養細胞系で外来遺伝子のsite-specificで高率な導入の結果が得られている。本年度は、このcre/ψloxp系を利用したTgマウスの作出を試みた。まず、受精卵の前核内でcre/ψloxp系が作用するかどうかを調べるために、CMV/loxp/stuffer/loxp/lacZプラスミドとcre酵素を共に前核に顕微鏡注入した結果、laczの発現が観察された。つぎに、cre酵素に変えてCAG/creプラスミドを共注入し、胚を借親に移植した結果、胎児ならびに新生小マウスの25%でTgマウスが得られた。以上、本研究で得られた成果は、Tg家畜を作出する上で極めて有効な手段として利用できることが示された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1998 - 2000

【配分額】30,600千円 (直接経費: 30,600千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】08308040 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゼブラフィッシュ / メダカ / 神経形成 / 成長因子 / 転写因子 / 核移植 / 変異体形成 / ゼブラフィシュ / Zebrafish / development / BMP-4 / islet-2 / medaka / transgenic / protocadherin / 神経機能 / 発生・分化 / 胚操作 / 遺伝子導入

【研究成果の概要】

三品昌美(東京大学大学院医学系研究科薬理・分子神経生物学)らはtrimethylpsoralen(TMP)がゼブラフィシュに高頻度で変異体を生じることをみいだした。そして知覚神経突起の異常を起こすedawakare遺伝子を見出し解析した。若松祐子(名古屋大学生物分子応答研究センター)らは、メダカ卵の核移植法をもちいて、個体発生を調べた。32%がドナー遺伝子を発現し、4%が生体まで成長した。中安博司(岡山大学理学部生物学)らは、ゼブラフィシュ単離脳を培養し、その神経科学的有効性を、組織化学法を用いて解析した。岡本 仁(理化学研究所脳科学総合研究センター発生遺伝子制御)らは、知覚および運動神経の神経回路網形成にIslet-2が関係していることを、LIM/homeodomainの過剰発現により見出した。三木直正(大阪大学大学院医学系研究科情報薬理学)らは、新規のzfhファミリーの転写因子を見出し、これが、背腹軸形成に関与していることを、過剰発現実験により見出した。上野直人(岡崎国立共同研究機構基礎生物学研究所発生生物学)らは、BMPが、外胚葉形成に関係していることを見出した。すなわち、MBPは、腹側に働き上皮を、背側に働き神経分化を抑制する。武田洋幸(名古屋大学大学院理学研究科生命理学)らは、神経形成に2つの経路があることを見出した。一つは、organizer factorsでBMPと結合する。他は、後神経を誘導するFGFで、BMPと結合する。
山形要人(東京都神経科学総合研究所分子神経生物学)らは、新しい最初期遺伝子のarcadlinを見出した。これは、LTPや電気ショックで誘導され、Cadherinほホモロジーがある。シナプスの可塑性に関係していると考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】28,800千円 (直接経費: 28,800千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】08406018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

トランスジェニック動物 / EGFP / PCR / DPnI / マウス胚 / トランスジェニック / 形質転換家畜 / 遺伝子導入 / α-ガラクトース / 制限酵素 / 蛍光蛋白 / 胚 / トランスジーン / シバヤギ / ホメオボックス / c-kit / SCF

【研究成果の概要】

1.シバヤギc-kit cDNAに見い出された特異的アラニン残基の挿入について、各種の動物を解析した結果、ウシ科の中でもヤギ、ヒツジに特異的な挿入であることが判明した。c-kitのリガンドであるSCFcDNAのクローニングを行なった結果、5つのisoformsが単離された。そのうちの二つは、従来報告されている動物種にない、新規のSCFのisoformsであった。2.マウスおよびシバヤギの胎盤形成過程におけるホメオボックス含有遺伝子群の関与について検討した。Degenerate oligonucleotide primeを用いたRT-PCR法による解析の結果、両動物種の胎盤において多数のホメオボックス遺伝子の発現が同定され、Hox a9,d9,Emx2.Msx2,ATBFIが、両動物種で共通して発現していた。また、Hox 09,d9の発現が胎盤形成過程において何らかの役割を果たしていることが示唆された。3.形質転換動物の作出効率を向上させる手段して、Bal 31とDpn IによるDNA消化とPCRとを併用したTg胚の選別を試みた。細胞質にDNAを注入し体外で後期胚に発生させたウシおよびマウス胚の98.6%で特異PCR産物は全く検出されなかった。一方、Tg胚のゲノムDNAを酵素処理した場合には、68.6%の胚でトランスジーンに特異的なPCR産物が検出された。また、70.5%のウシ胚でマーカー遺伝子に特異的なPCR物が検出され、Tg胚の選別に極めて有効であることが認められた。4.EGFPをマーカーとしてTg胚の選別法について検討した。受精卵前核にCMV・β-actin/EGFP遺伝子を顕微注入し生存胚を体外培養した。後期胚について蛍光顕微鏡で観察し、14.8%が胚全体で、22.6%がモザイク様の蛍光が観察された。つぎに、モザイク様に発光した胚と全体に発光した胚とに分類し偽妊娠ICRマウスの子宮へ移植した。前者から76.9%、後者から21.6%のTgマウスが得られた。本手法が、Tg胚の選別に極めて有効であることが認められた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】34,300千円 (直接経費: 34,300千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】07556063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

トランスジェニック / トランスジーン / EGFP / 緑色螢光蛋白 / 胚 / PCR / 制限酵素 / Bal31 / Dpn I / シバヤギ / トランスジェニック胚 / 遺伝子導入 / エキソヌクレアーゼ

【研究成果の概要】

Tg家畜作出における最大の課題は、Tg動物の作出効率がマウスに比べ著しく低いことである。家畜への遺伝子導入は、これまで、受精卵前核へのDNA顕微注入法によってのみ行なわれているが、胚発生の階段で、Tg胚を選別できれば、Tg動物の作出効率を顕著に向上させることができる。最近、Green Fluorescent Protein(GEP)をマーカーとするTg胚の選別法が開発されつつあるが、なお、胚におけるGFPの一過性発現と持続性発現との区別が明瞭でない。本研究は、マウス胚を材料に、enhancedGFP(EGFP)をCMVenhance・chiken β-actin promoterに連結した融合遺伝子(CMV・β-actin/EGFP)をマーカーとした高精度のTg胚選別法を確立するために行なったものである。C3B6F1マウス由来の受精卵前核にCMV・β-actin/EGFP遺伝子を顕微注入し生存胚を体外培養した。その後、4細胞、8細胞、桑実胚、胚盤胞期に、それぞれ蛍光顕微鏡(GF-1フィルター)で観察し、後期胚について、モザイク様に発光した胚と全体に発光した胚とに分類した。それらの胚の一部を、我々の研究室で開発したBal31・Dpnlを用いるTg胚選別法(Soe et al,1997)により、蛍光発光とTg胚との関係について解析した。他の胚は、偽妊娠ICRマウスの子宮へ移植し、生まれたマウスのTg個体について解析した。なお、対照には非発光胚を用いた。4細胞期および8細胞期で蛍光発光が観察された場合もあったが、大部分は桑実期以後に強い発光が観察された。Soeらの方法によりTg胚を解析した結果、発光胚の約80%以上がTg胚と判定された。一方、非発光胚でも極一部Tg胚の存在が確認された。なお、移植実験の解析は現在進行中である。また、胚におけるEGFPの発現が、培養液の鮮度に強く影響されることが認められた。以上の結果から、EGFPをマーカーとするTg胚の選別には、全体に発光する胚のみをTg胚として判定することが重要であると考えられ、本選別法が、Tg家畜の作出効率を向上させる上で手極めて有効な手段であることが確認された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】19,100千円 (直接経費: 19,100千円)