【研究分野】生物・生体工学

【研究領域課題番号】13450337 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体 / ファージ提示法 / 変異導入 / 自己抗原 / 結晶構造解析 / 発現系 / 分子認識 / 巻き戻しシステム / 抗原抗体相互作用 / 蛋白性抗原 / X線結晶構造解析 / 熱力学的解析 / 変異体 / 非共有結合 / 蛋白質間相互作用

【研究成果の概要】

本研究では、ヒト抗体ゲノム情報に基づき、(1)遺伝子レベルの多様性の創出、(2)抗体の分子認識能による安定な生体外選択、(3)選択された抗体の高効率な調製系を構築することにより、生体内の免疫系を凌駕するような新機能ヒト抗体分子調製系の構築を目標とした.研究期間中の研究成果は以下の通りである.1.遺伝子の多様性:マウス、ヒト由来抗体可変領域を特異的に増幅できるDNAプライマーを設計、その増幅条件を検討した.抗体可変領域への無作為変異導入法として、Error-pronePCR法をとりあげ、無作為変異導入が可能な条件を検討し、金属イオンと反応時間の調節が重要であることを見出した.2.選択:可変領域断片が抗原存在下で安定になる機構を用いた選択を確立した.EGF受容体特異的ならびにNK細胞阻害性受容体(KIR)特異的ヒト抗体,生分解性プラスチック表面,金表面特異的抗体の選択・調製に成功した.1.で述べた手法により、ヒト型化した抗体へ無作為変異を導入、標的分子発現細胞を直接用いた選択を試みることにより、数箇所への変異導入により親和性の顕著な上昇を見ることができた.また,BIAC0RE2000のフロー・リアルタイムモニターリングシステムを用いた,選択法を確立した.3.調製系:抗体・各種サイトカイン等の調製に関して、添加剤の効果を考慮に入れた巻き戻し法の改良を試みた.アルカリホスファターゼなどの酵素との融合あるいは2種類の抗体断片や免疫賦括剤(サイトカイン)との融合を試み、安定な調製系を構築した.モデル抗体の分子認識能を詳細に解析した.抗体調製に関する巻き戻しシステムの分光学的解析を行った.4.選択された抗体の高効率な調製系の構築と構造解析:(2)で得られたヒト抗体可変領域について,大腸菌の高発現系で可溶性分子として調製し、精密な結合定数を測定した.また、生分解性プラスチック表面特異的抗体の分子認識機構を明らかにした.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】14,400千円 (直接経費: 14,400千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】05454564 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体 / 免疫グロブリン / X線結晶構造解析 / 抗原 / 親和性成熟 / 分子認識機構 / 蛋白質結晶化 / Fabフラグメント

【研究成果の概要】

抗原に対する抗体の親和性は体内の抗原の量に応じ時間とともに増大する。抗体の親和性の成熟と呼ばれるこの現象の分子機構をX線結晶解析による三次元構造知見に基づいて解明するため,親和性成熟の過程の抗体について解析に適したFabフラグメント結晶を得ることを目的とした。
免疫応答の初期に産生されるN1G9,中期の3B44,および後期の3B62のマウスIgG_1抗ニトロフェノール(NP)抗体の培養法とFabの調製法を改良し,試料の大量精製法をまづ確立した。ついで,X線解析に適した結晶を得るための結晶化条件を最適化した。得られた3種のFab結晶はいずれも微小であったが,十分にX線解析が可能なことが判明した。このうちN1G9と3B44についてはFab結晶とNPとの複合体結晶のX線回折強度データを収集し,X線解析に着手した。3B62については,高分解能の回折斑点を与える結晶には双晶成分の回折斑点が認められた。そこで,結晶化と強度データの収集の方法をさらに改良することとしている。
目的とした結晶化とX線結晶解析の見通しの確立の成果の学会発表を既に行い,現在投稿論文を準備中である。しかも,N1G9についてはFab自体と複合体の双方の結晶の解析を既に進め,構造の概略のみならずNPの結合部位の大まかな環境も知ることができた。3B44についても3A分解能で結晶中の分子配置を決定している。したがって,これらFab構造の詳細なX線解析が可能となり,親和性成熟の分子機構の研究は今後大いに進展するものと期待される。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1993

【配分額】6,100千円 (直接経費: 6,100千円)

【研究分野】結晶学

【研究領域課題番号】02558011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微小結晶 / 蛋白質 / X線結晶構造解析 / イメージングプレート / シンクロトロン放射光 / 異常分散法 / 免疫グロブリン / 抗体 / X線結晶構造解析法 / 蛋白質結晶学 / 回折強度測定法 / イメ-ジングプレ-ト / 多波長異常分散法

【研究成果の概要】

微小蛋白質結晶のX線構造解析法の開発を目的とし、輝尽性蛍光体イメージングプレートを採用した高感度で高精度のX線カメラ露光リアルタイム検出装置を試作し、X線異常分散効果を利用して構造解析の処理を行うための計算機プログラムシステムを開発した。これらを用い、シンクロトロン放射光による異常分散効果を最適化した回折データを微小蛋白質結晶について測定し、抗体など3種の蛋白質の結晶構造を解析した。
ダンシルリジンに結合するマウス抗体のFvフラグメントについて、多波長異常分散法用の回折データ処理と異常分散項の算出処理のプログラムを用いて解析を進めた。その結果、異常分散パターソン合成による相補性決定部位のメチオニンに結合した白金のサイトを得ることができた。その後、分子置換法とモデル精密化法を併用してこのFvフラグメントの結晶構造を1.6A分解能という抗体では最も高い精度で解析を完了することができた。白色X線による異常分散効果の測定系と処理系も新たに開発し、ラウエ回折法に基づく今後の時分割実験による動的構造研究でも適用可能となった。
マウス抗ニトロフェノール(NP)抗体3B44のFavフラグメンの微小結晶について、開発した検出装置を用いることにより3A分解能の回折データを得ることができた。このものの臭素化NPとの複合体の多波長データでは臭素化NPの結合が十分でなかったため分子置換法を適用し、3A分解能で構造解析に成功した。また、抗体NIG9のFabでも結晶が微小で従来法では回折データが得られなかったが、開発した測定処理系によって2.5A分解能の良好なデータを得た。さらに、リボヌクレアーゼU_2も1.8A分解能での解析を完了した。このものの異常分散差フーリエ合成ではイオウ原子のみを明瞭に電子密度として見いだすことができた。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1992

【配分額】17,500千円 (直接経費: 17,500千円)