【研究領域課題番号】21H02412 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / 膜輸送 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 薬剤耐性化

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究領域課題番号】18K06148 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Na+,K+-ATPase / イオン能動輸送 / 膜蛋白質 / X線結晶構造解析 / 能動輸送 / イオン選択性 / 電子顕微鏡単粒子解析 / 脂質二重膜 / Na+ポンプ / イオン選択機構 / 量子化学計算

【研究成果の概要】

Na+,K+-ATPaseは全ての動物細胞の細胞膜に局在し、ATP 1分子の加水分解エネルギーを利用して3個のNa+を細胞外へ、2個のK+を細胞内へ濃度勾配に逆らって輸送する膜蛋白質である。Na+の選択的輸送の理解に向けてNa+を結合した直後の状態、すなわちE1・3Na+状態の構造解析を行った。また、E1・3Na+状態の結晶を用いて、E1・Mn2+状態の構造、ATPアナログと結合したE1・3Na+状態およびE1.Mn2+状態の構造も明らかにした。これらの構造解析から、Na+ポンプはNa+を結合した時のみ燐酸化状態に進める、言わば安全装置のような仕掛けがあることが明らかになった。

【研究の社会的意義】

Na+,K+-ATPaseは生体内ATPの60%以上を消費するとも言われ、それによって形成されるイオン濃度勾配は様々な生命活動の基盤を成している。Na+,K+-ATPaseの異常は神経変性など多くの疾患の原因となるだけでなく、癌などに対する薬剤標的としてもNa+,K+-ATPaseは有用であることが多く示されている。したがって、その能動輸送の詳細な理解は学術的にも産業的にも重要である。本研究はなぜ、Na+だけを選択的に輸送できるのか、その仕組みを原子レベルで明らかにした。その巧妙な仕組みは学術的に興味深いだけでなく、遺伝性疾患におけるNa+,K+-ATPaseの異常の理解にも役立つものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】18K06079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物化学 / X線結晶構造解析 / ABC輸送体 / 膜蛋白質 / 薬剤耐性 / 構造生物学 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析 / 膜輸送体

【研究成果の概要】

本研究では、ATPを利用して基質を能動輸送するATP-binding cassette（ABC）輸送体のうち、外膜チャネルと膜融合蛋白質と複合体を形成して基質の輸送を行う三者複合体形成型輸送体MacBについて、その基質輸送機構を解明することを目的とした。2017年に我々は分解能3.4オングストロームでMacBの結晶構造を明らかにしたが、本研究では新たに別のMacBホモログで分解能2.0オングストロームのより精密な構造解析に成功した。さらに複数の別条件の結晶からも構造を得た。それらの構造を比較することにより、MacBの構造変化が観察され、基質輸送機構の理解につながる新たな知見が得られた。

【研究の社会的意義】

本研究の対象であるMacBは、マクロライド系抗生物質やペプチド毒素、リポ多糖等の生物学的に重要な物質の排出に関与しており、その排出機構を解明することは、創薬のみならず生命現象の理解という観点からも非常に有用な情報が引き出せると期待される。本研究で明らかとなったMacBの構造変化は、従来のABC輸送体とは大きく異なるものであった。これらの結果から、詳細が解明されていないMacBを含むVII型ABC輸送体の基質輸送の分子機構について、新たなモデルを提唱した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】18H02386 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜輸送 / 膜蛋白質 / 薬剤耐性 / ABC輸送体 / 薬剤排出

【研究成果の概要】

新しいMacBホモログの高解像度での構造解析を完了した。これは2017年に我々が報告したものと比べ、重要な構造変化が観られた。既知の構造情報、さらに、RND型輸送体の知見も併せ、基質をペリプラズムで捉えて、外膜チャネルを介して輸送する三者複合体形成型輸送体複合体に特徴的な基質輸送機構であることが分かり、それをperiplasmic alternating access mechanismと名付け、これを提唱した。さらに、これは従来のABC輸送体と構造と機能が大きく異なるため従来の分類方法に沿わず、新たなクラス分けの方法についても提唱するに至った。当該研究分野での新しい分野を拓いたと言える。

【研究の社会的意義】

感染症は人間社会を一変させることを我々はここ1，2年で思い知った。ウイルス感染症に限らず、細菌感染症もまた脅威である。抗生物質はその有効性を徐々に失いつつある。ウイルスの陰で薬剤耐性菌が増えているという事実も報告され始めた。嫌なニュースである。抗生物質の能動的な排出の機構の理解は、輸送阻害剤の開発のほか、排出されにくい薬剤の設計にも利用可能な知見であり、人類の福祉にとって極めて重要な研究内容であると考える。基礎学問的にもどのようにしてグラム陰性細菌が斯くも多様なトランスポーターを分子進化のなかで保持してきたのかという興味に一歩近づけたと考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】17H03640 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Ｘ線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 多剤耐性菌 / 薬物動態 / 結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 輸送体 / 多剤耐性因子

【研究成果の概要】

生体は常に有毒な有機分子にさらされているが、細胞は防御策としてこれらを排出する機構を有している。この排出機構の分子実体は膜タンパク質である「排出輸送体」である。本研究では有機分子の排出機構に着目し、多剤排出輸送体MATEの構造解析を行った。
真核生物由来MATEに関しては，昨年度、シロイヌナズナ由来MATE輸送体AtDTX14の外向き開状態の構造を決定し、構造に基づいた変異体解析を行い、輸送機構を検証した。一方で、真正細菌由来のMATEであるVcmNについても構造解析を行った。本構造解析の結果から、VcmNはH+駆動力依存的なTM1折れ曲がりにより基質を排出することが示唆された。

【研究の社会的意義】

生体は常に有毒な有機分子にさらされているが、細胞は防御策としてこれらを排出する機構を有している。これらの排出にかかわるMATE輸送体は細胞内外の物質の分布を制御する役割を担うため、その輸送機構を解明することは生命現象を理解するうえで必須であり、さらに医薬への応用などにおいても重要である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】16K18500 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Na+,K+-ATPase / パリトキシン / X線結晶構造解析 / イオン能動輸送 / 膜蛋白質 / Na+ポンプ / イオンポンプ / イオンの能動輸送

【研究成果の概要】

海産毒物パリトキシンはナトリウムポンプを標的として毒性を示す。ナトリウムポンプは本来、ナトリウムイオンとカリウムイオンを細胞内外へ能動輸送する膜蛋白質だが、パリトキシンと結合するとそのポンプ機能が失われて、チャネル化することが分かっていた。では、どのようにしてパリトキシンはナトリウムポンプをチャネル化するのか、その仕組みを明らかにするために、パリトキシンと結合したナトリウムポンプの立体構造解析を行った。その結果、パリトキシンはナトリウムポンプのイオン輸送経路の細胞外側に結合し、そのゲートをこじ開けていることが分かった。

【研究の社会的意義】

本研究成果は根本的治療法がないパリトキシン中毒に対する薬剤デザインに大きく役立つものです。また、本研究成果は、本来、ポンプとして機能するはずのナトリウムポンプはなぜ、パリトキシンの結合によってチャネル化するのか、言い換えれば、ポンプとして機能するためには何が大事か、というイオン能動輸送に対する基本的な理解に役立ちました。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】16K18866 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

HBV / 溶液NMR / B型肝炎ウイルス / NMR / 構造生物学 / B型肝炎ウィルス / X線結晶構造解析 / ウイルス / 膜タンパク質

【研究成果の概要】

B型肝炎ウイルス（HBV）の感染により発症する慢性B型肝炎は、肝癌や肝硬変のリスク因子である。現在の治療薬は核酸アナログとインターフェロンのみであり、ウイルスを排除できないことが問題である。そこで本研究では、HBV感染の構造メカニズムを明らかにし、治療薬創製の構造基盤を得ることを目指した。
感染に重要なHBVの外殻タンパク質であるpreS、preS1、preS2の大量調製法を確立し、NMRシグナルの帰属を行うことで、HBV受容体であるNTCPとの相互作用解析の準備が整った。NTCPは大腸菌での発現に成功した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】25291011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 多剤耐性菌 / 膜輸送体 / Ｘ線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 薬物動態

【研究成果の概要】

多剤排出輸送体は，多様な薬剤を認識し排出することで薬物耐性細胞出現の原因となっている．この幅広い薬剤に対する認識・排出機構の理解は，創薬の観点からも重要である．しかし，膜蛋白質の構造解析は困難であり，近年いくつかの多剤排出輸送体の構造が解明されたが，分解能の低さのため，基質認識など生物学的に重要な点が依然不明のままである．本研究では，多剤排出輸送体として同定され，その後の研究により芳香族アミノ酸も排出する輸送体と判明したYddGの構造機能解析を行った．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】22687007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X 線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 膜輸送体 / ドラッグデリバリー / 多剤排出因子 / X線結晶構造解析

【研究成果の概要】

細胞内外の環境維持に重要な能動輸送体は,エネルギーを消費して細胞膜を介した物質輸送を行う膜蛋白質であり,二次性輸送体は一次性輸送体が作り出したH+,Na+等のイオンの濃度勾配をエネルギー源として,低分子化合物を能動的に輸送する役割を持つ.特にこの二次性輸送体は,アミノ酸,核酸,糖,薬剤など,重要な生理活性物質の細胞内外の分布を決定づけている.そのため,これらの輸送体のヒトにおける機能異常は様々な疾病と深く関係している.本研究は,生物学的,医学的応用の両面から重要である二次性能動輸送体,多剤排出輸送体MATE,Ca2+カチオン交換体CaCA,オリゴペプチド輸送体POTのX線結晶構造解析・機能解析を行った.

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】11878112 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 膜蛋白 / 結晶化 / 膜輸送 / 薬剤排出 / テトラサイクリン

【研究成果の概要】

1、テトラサイクリン排出タンパクの結晶化及び結晶構造解析に向けて、その基盤となる大量産生と大量精製法の条件検討を行った。その結果、1週間ほどの培養〜精製の行程で、30mg程の純化したテトラサイクリン排出タンパクを得る系の確立に成功した。この量は結晶化の実験に用いるには不足は無く、結晶化実験に向け基盤を固めることができた。
2、膜蛋白質の結晶化に於いて最も影響の大きな因子の一つである界面活性剤の選択に関して本年度は、その可溶化力を市販の物ほぼ全てに関してその効果を検討した。約100種類の界面活性剤のうち、ある種の合成リン脂質誘導体が蛋白質を効率よく膜から可溶化し、且つ精製後も蛋白質標品を安定に保つ事を見出した。この界面活性剤で安定化させたテトラサイクリン排出タンパクは水溶液中でも安定で結晶化が起こる一般的な蛋白濃度である10mg/mLもの高濃度でも非特異的会合を起こさない事が分かった。今後、界面活性剤の蛋白質標品の安定化に及ぼす影響をさらに検討する。
3、生物分子工学研究所(BERI)木村能章博士との共同研究により、精製したテトラサイクリン排出タンパク分子を合成リン脂質シートに再構成し、相転移によりシート中のたんぱく質濃度を上昇させる手法で初歩的な2次元結晶化に成功した。このシートの電顕像のフーリエ変換像には分子配列に規則性があることを示すピークが認められた。
4、3次元結晶化に関しては、市販の結晶化条件スクリーニングキットを用いて初歩的なスクリーニングを行った。今後リン脂質の系に再構成する条件検討の結果を応用し、Lipid cubic phase 法による結晶化を行って行く予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)

【研究分野】生体物性学

【研究領域課題番号】03304056 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜タンパク質 / 結晶化 / X線結晶構造解析 / 結晶成長機構 / タンパク質立体構造予測 / 超分子複合体 / タンパク質立体構造形成機構 / 電子線構造解析 / 結晶構造解析 / チトクロム酸化酵素 / チトクロムbc_1複合体

【研究成果の概要】

過去3か年にわたる研究の結果、膜タンパク質スーパーコンプレックスの構築原理と結晶化条件の一般化に関して以下のことが明かになった。
膜タンパク質の立体構造の安定化の要因は膜貫通ヘリックス間の水素結合と静電的相互作用である。それに加えて、親水性部分が安定化に寄与している。したがって、脂質二重膜に埋まった疎外性表面を界面活性剤で覆って水溶液中に‘可溶化'することは立体構造を損なわずに膜タンパク質を単離する最もよい方法であろう。しかし、この結合している界面活性剤を介した相互作用は非特異的で、結晶の安定化に寄与するとは考えられない。したがって、親水性部分の大きな膜タンパク質ほど結晶化は容易であると推定できる。ウシ心筋チトクロム酸化酵素やチトクロムbc_1複合体は結晶化されているが分子量がそれらの約1/2である細菌の相同タンパク質はまだ結晶化されていないことは、この推定を支持している。結晶化の必要条件は標品の純度ではなく立体構造が完全であることである。さらに周期的な配列が可能になるためには、必ずしも分子間の相互作用が強ければよいわけではない。界面活性剤の種類によってこのような相互作用を制御することができる。例えば、チトクロム酸化酵素結晶のx線回析の分解能を6.5Aから3.5A以上に、界面活性剤の種類を変えることによって、一挙に向上させることができた。巨大な分子の結晶では、安定化を促進する相互作用が体積当りでは弱くなるため、結晶の完全性に限界があるという説もあるが、逆にいくら大きくてもそれが生理活性をもったタンパク質であるかぎり結晶化は可能であるとも考えられる。何故なら大きなタンパク質ほど立体構造の動的なゆらぎを小さくするような構造があるため、全体として安定であるだけでなく、特異的な相互作用も揺らぎが小さいだけ強くなるであろうからである。

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1990 - 1993

【配分額】17,000千円 (直接経費: 17,000千円)