【研究領域課題番号】18H03980 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / タンパク質 / ＲＮＡ / 複合体 / 分子機構 / RNA / X線結晶解析 / 修飾酵素 / プロセシング / 結晶構造解析 / 蛋白質 / 構造 / 機能 / X線 / 構造解析 / 機能解析 / RNA－蛋白質複合体 / X線構造解析 / ノンコーディング / 鋳型非依存 / 機能制御

【研究成果の概要】

本研究では、高次生命現象を支配する鋳型非依存的ＲＮＡ合成酵素のうち、let7 miRNAの発現を制御するTUT4/7によるポリU付加の分子機構をLin28と相互作用するTUT4/7の領域の構造解析、生化学的解析より明らかにした。また、U6 snRNAの成熟化に関わるTUT1によるポリU付加の分子機構をTUT1とU6 snRNAの複合体構造解析、生化学的解析より明らかにした。RNAのポリA鎖にA/Gミックス鎖を付加するTENT4/Bの構造解析に成功し、ヌクレオチドの特異性に関する知見を得た。また、各種RNA修飾酵素、プロセス酵素の構造決定に成功し、それらの酵素の反応制御機構を明らかにした。

【研究の社会的意義】

本研究で明らかにしたTUT4/7によるpre-let7のLin28依存的ウリジル化の分子機構はがん抑制作用のあるlet7 miRNAの発現を制御する薬剤開発の基盤になり、また、U6 snRNAの成熟化に関わるTUT1によるウリジル化の分子機構はU6 snRNAの成熟化異常に起因する疾病に対する薬剤の開発の基盤になると期待できる。また、HBCなどのmRNAを安定化させるTENT4A/4Bの特異性の分子機構解明はウイルスの増殖に対する薬剤の開発などの基盤となると期待できる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】43,810千円 (直接経費: 33,700千円、間接経費: 10,110千円)

【研究領域課題番号】18K06079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物化学 / X線結晶構造解析 / ABC輸送体 / 膜蛋白質 / 薬剤耐性 / 構造生物学 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析 / 膜輸送体

【研究成果の概要】

本研究では、ATPを利用して基質を能動輸送するATP-binding cassette（ABC）輸送体のうち、外膜チャネルと膜融合蛋白質と複合体を形成して基質の輸送を行う三者複合体形成型輸送体MacBについて、その基質輸送機構を解明することを目的とした。2017年に我々は分解能3.4オングストロームでMacBの結晶構造を明らかにしたが、本研究では新たに別のMacBホモログで分解能2.0オングストロームのより精密な構造解析に成功した。さらに複数の別条件の結晶からも構造を得た。それらの構造を比較することにより、MacBの構造変化が観察され、基質輸送機構の理解につながる新たな知見が得られた。

【研究の社会的意義】

本研究の対象であるMacBは、マクロライド系抗生物質やペプチド毒素、リポ多糖等の生物学的に重要な物質の排出に関与しており、その排出機構を解明することは、創薬のみならず生命現象の理解という観点からも非常に有用な情報が引き出せると期待される。本研究で明らかとなったMacBの構造変化は、従来のABC輸送体とは大きく異なるものであった。これらの結果から、詳細が解明されていないMacBを含むVII型ABC輸送体の基質輸送の分子機構について、新たなモデルを提唱した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】16H02494 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自然免疫 / X線結晶構造解析 / Nod様受容体 / Toll様受容体 / TLR / X線結晶解析 / 構造生物 / X線解析 / NLR

【研究成果の概要】

自然免疫は病原体の感染をいち早く察知し炎症反応を引き起こす一方、後に続く獲得免疫を誘導するという極めて重要な役割を果たす。本研究では自然免疫に関わるタンパク質に注目し、リガンド認識機構、活性制御機構を明らかにすることを目的とした。細胞質型の自然免疫センサーとしてADP結合型のNOD2の構造解析に成功し、詳細な構造を明らかにした。またLRRドメインにリガンド結合部位と思われる領域を同定した。また一本鎖核酸を認識する膜結合型の自然免疫センサーであるTLRの構造研究にも取り組みその共通性を見出した。さらにmRNAの安定性を制御するRoquin-2の構造解析にも成功しそのRNA認識機構を明らかにした。

【研究の社会的意義】

NLRの構造は数例に限られており、NOD2の構造情報はNLRの活性化機構を解明するうえで重要な情報となる。一本鎖核酸を認識するTLRが有する共通性「リガンド結合部位が2ヶ所あり別々のリガンドが各部位に結合することにより協調的に活性化する」を解明したことは大きなインパクトを与えた。特にTLR7,8は低分子化合物によって活性化されることが知られており、立体構造情報はあらたな化合物開発に多大な貢献を示すと考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】43,290千円 (直接経費: 33,300千円、間接経費: 9,990千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】15K14471 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ダイオキシン / 環境ホルモン / 構造生物学 / Ｘ線結晶構造解析 / Ｘ線結晶解析

【研究成果の概要】

ダイオキシン受容体として知られる芳香族炭化水素受容体（AhR）の構造生物学的研究を進めた。核移行前複合体の調製を試みたが成功しなかった。AhR抑制複合体であるAhRR/ARNT複合体の結晶化を進め、その結晶構造を明らかにした。転写活性化複合体であるAhR/ARNT複合体の構造解析に向けて、種々の生物種由来のAhR/ARNT複合体の調製や、様々な変異体の発現と精製を試みた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】25291010 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Toll様受容体 / 自然免疫 / X線結晶解析 / 一本鎖核酸 / １本鎖核酸 / X線結晶構造解析 / Ｘ線結晶構造解析

【研究成果の概要】

Toll様受容体(TLR)は細菌やウイルスなど病原体の分子パターンを認識するセンサーとして働く。TLR7/8は一本鎖RNA、TLR9はCpG配列を含む一本鎖DNAによって活性化されるが本研究はこれらのTLRに注目してその構造科学的な研究を行いリガンド認識機構や活性化機構を明らかにすることを目的とする。本研究により、TLR8は一本鎖RNAの分解産物であるウリジンおよび短鎖ssRNAによる協調的な効果により活性化されることを示した。一方TLR9は、CpG-DNAがTLR9の片方のプロトマーのN末側ともう一方のプロトマーのC末側を結び付けて二量体化していることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23227003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ピクセル検出器 / タンパク質結晶構造解析 / タンパク質溶液散乱 / DEPFET検出器 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / X線溶液散乱 / X線結晶解析

【研究成果の概要】

タンパク質のＸ線構造解析用に、素粒子実験向けに開発された最新のピクセル型検出器DEPFET（DEpleted P-channel Field Effect Transistor）を応用した高精細高速読み出し検出器を制作した。放射光Ｘ線を用いた評価実験を行い、DEPFETが既存のＸ線検出器を上回る位置測定精度でタンパク質結晶や溶液からの回折像を撮影でき、しかも高速なヒット情報の取り出しが可能なことを示した。センサーモジュールを並べてメガピクセル級の大面積検出器を構成することで、高難度タンパク質の微小結晶構造解析や時分割溶液散乱へ適用され、新しい測定・解析技法が切り拓かれることが期待される。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2011-04-01 - 2016-03-31

【配分額】209,820千円 (直接経費: 161,400千円、間接経費: 48,420千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】22370045 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

相同組み換え / メディエーター / リコンビナーゼ / X線結晶構造解析 / Ｘ線結晶解析

【研究成果の概要】

リコンビナーゼであるRad51は相同組み換えにおいて中心的な働きをする。生体内で組換えが起こるときはRad51に加え、メディエーターと呼ばれる補助因子を必要とする。Swi5-Sfr1複合体はメディエーターとして同定され、その後の研究によってリコンビナーゼの活性化因子として働くことが示された。この因子の構造科学的な知見を得るためX線結晶解析により構造決定したところ、ブーメラン様の構造をとっており、Rad51フィラメントの溝に入り込めるような形状をしていた。Swi5-Sfr1はフィラメントの溝に入り込み、フィラメントを安定化していることが強く示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】15570101 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CBL2 / EF-hand / カルシウム / X線結晶解析 / CIPK / カルシニューリン / 植物 / X線結晶構造解析 / EFハンド / カルシウムセンサー

【研究成果の概要】

植物においては光、塩など様々なストレス因子がシグナルとなり細胞内のカルシウム濃度が上昇する。カルシウムセンサー蛋白質は細胞内のカルシウム濃度の上昇に伴い活性化されシグナルを下流へと伝える。最近CBLという新規な蛋白質が同定され、引き続きCBLの標的蛋白質としてCIPKが同定された。CBL/CIPK経路は塩ストレスなどで深く関与していることが示されており、生理学的な重要性も次々と解明されてきている。一方この経路は高等植物にも広く分布していること、さらにはゲノム研究からCBL,CIPKともに複数存在していることが判明している。これらのことからCBL/CIPK経路の重要性と広範な働きが予想できる。この経路の構造生物学的解明はCBLのカルシウムによる活性化機構、CIPKの認識機構などCBL/CIPK経路の構造的基盤を与えるものと考えられる。
シロイヌナズナには10種類のCBLファミリーがあるがCBL2を選び、サンプル調整を行い結晶化に十分量のタンパク質を得、タンパク質の結晶を得ることに成功した。最終的にはモデルの信頼性を示すR因子が20.4%、フリーR因子が24.8%という信頼度の高いモデルを得ることに成功した。
カルシウム結合型CBL2はαヘリックスリッチな構造をとっており、分子内に擬似的な二回軸をもっていた。CBLの構造よりCIPKの活性化モデルを提唱した。CBL2は4個のEFハンドモチーフ(EF-1〜EF-4)を持つが、カルシウムの電子密度が確認されたのは、EF-1とEF-4の2箇所であった。EF-2及びEF-3ではカルシウムは同定できなかったが、内部の密な水素結合のネットワークによって安定化されており、open conformatioをとっていることが示された。本研究はCBLファミリーに属するタンパク質の最初の結晶構造解析である。またCIPK14の複合体構造をめざしサンプル調整を行った。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)