【研究分野】形態・構造

【研究領域課題番号】16K14766 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロラクチン / 軟骨魚類 / 両生類 / 脳下垂体 / 環境適応 / 変態 / 進化 / 受容体 / 体液調節 / 多機能化

【研究成果の概要】

本研究は、水電解質代謝や生殖活動を含めて300以上もの生物学的機能が知られる多機能ホルモン、プロラクチン (PRL) の起源と進化を理解することを目的としている。軟骨魚類においてすでにPRLとその受容体が存在することを明らかにし、その作用が脳下垂体における傍分泌作用であることも見出した。また、両生類のウシガエルでは、魚類PRLのオルソログであるPRL1Bが幼生期に、四肢動物PRLのオルソログであるPRL1Aが変態最盛期以降に高い発現を示し、分子進化と機能の進化との間の関連が示唆された。特異的な抗体やイムノアッセイなどの実験系も確立し、ノックアウト系統の作出も進めている。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】基礎獣医学・基礎畜産学

【研究領域課題番号】24380161 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

繁殖生物学 / プロラクチン / 選択的スプライシング / シグナル伝達 / 性周期 / 獣医学 / 生理学 / 畜産学 / 遺伝学 / 受容体 / 乳腺 / 遺伝子

【研究成果の概要】

成熟雌ラットの性周期各時期に卵巣を摘出し、プロラクチン受容体ロングフォーム、ショートフォームについてリアルタイムPCRおよびウェスタンブロットを行ったところ、黄体退行の始まる時期である発情休止期の午後に、ロングフォームとショートフォームの発現比率がRNA・タンパクレベルで逆転した。そこでロングフォームの発現のみを抑制するスプライシング切替オリゴマーを持続的に投与し、血中性ステロイド濃度の測定を行ったところ、薬剤用量依存的に発情休止期の延長がみられた。以上より、ロングフォームが黄体の機能、および寿命の決定に中心的な関わりをもつことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】18,330千円 (直接経費: 14,100千円、間接経費: 4,230千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】04454105 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

乳腺 / レセプター / プロラクチン / インシュリン / MAPキナーゼ / 細胞増殖 / 成長因子 / 分化 / 乳腺上皮 / ホルモン / P34^<cdc2>キナーゼ / P32^<cdk2>キナーゼ / 分裂調節 / シグナル伝達

【研究成果の概要】

インシュリン、インシュリン様成長因子(IGF)-I、EGFなどの成長因子は細胞培養系では乳腺上皮細胞の増殖にとって必須である。プロラクチンとプロゲステロンはこれと協同して増殖を促進する。インシュリン、IGF-I、EGFはシグナル伝達過程において、MAPキナーゼを燐酸化し、活性化する。そこで最初に、乳腺上皮の増殖の盛んな妊娠初期と、増殖の盛んでない泌乳期の乳腺をMAPキナーゼの抗体を用いてウェスタンブロットにより調べたところ、そのいずれの時期にもMAPキナーゼが存在し、レセプターからのシグナルが伝えられると活性化される状態にある。MAPキナーゼの燐酸化状態を電気泳動距離の変化から推定することは試みたが、まだ成功していない。次に、プロラクチンにより特異的に増殖が刺激されるNb2細胞を同期化して、同様にMAPキナーゼをウェスタンブロットにより検出したところ、プロラクチンの刺激により変化が見られず、また、酵素活性にも変化はなく、プロラクチンのシグナル伝達にはMAPキナーゼが関与していない可能性がある。Nb2細胞では、プロラクチンの刺激により核内の発癌遺伝子c-mycは活性化されることが知られているので、MAPキナーゼが活性化されることなく、他の経路によりシグナルが伝達されるものと考えられる。また、乳腺は周期中でも妊娠中でも、必要なホルモンがあれば、いつでも最終分化して泌乳を開始する。最終分化にはプロラクチンのレセプターが誘導されることが必要条件である。今回、競合阻害を利用したPCR法により、このプロラクチンのレセプターの誘導をmRNAレベルにおいて明らかにした。すなわち、最終分化の際には、糖質コルチコイドによって、新たにプロラクチンのレセプターが転写され、プロゲステロンがこれを抑制する。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,600千円 (直接経費: 6,600千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】03454096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロラクチン / プロラクチンレセプター / 細胞膜レセプター / 乳腺 / ホルモン依存性解離 / 負の相互作用 / スカッチャードプロット / ヒルプロット / レセプタ- / 解離機構 / 高濃度プロラクチン

【研究成果の概要】

本年度は研究の最終年度である。二年間において以下の研究を行ない、新らしい成果を明らかにした。大別して二方向から研究を行なった。
従来から、プロラクチンレセプターは、細胞膜のみならず、細胞内にも多量に存在することが知られていた。著者は、アッセー終了時に細胞を酸で処理することにより識別出来ると考え、その条件を明らかにした。その結果、プロラクチンは細胞内に自由に取り込まれること、細胞内に存在するレセプターと結合した。しかし、このプラクチンは、酸処理に強い抵抗性に示した。一方、細胞膜に結合したプロラクチンは、酸処理により容易に解隣した。レセプターの存在する場所により異なった性質を示した。又、それぞれは、異なった変動を示し、独立に制御されていた。新らしい研究の分野がひらかれた。次に、高濃度プロラクチンの生理作用を、反応速度の面から明らかにした。プロラクチン濃度が異常に高くなると、解離速度が速くなる。もし相互作用が無ければこのような現像は起こらない。そこでスカッチャード及びヒルプロットにより解析を行なった。いずれの結果も高濃度プロラクチンは、相互作用の存在を示した。プロラクチンが解離したレセプターは、本来の性質を保ったことから、高濃度プロラクチンの存在下では、レセプターが飽和するのでなく、むしろ結合反応の頻度が著しく増加する、ことを示している。このような現像は他のホルモンにおいても認められ、同様な機構であると予測することが出来る。一般にこれらのホルモンが異常に高くなると体の異常を引き起す。その機序を開明出来た。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1991 - 1992

【配分額】4,800千円 (直接経費: 4,800千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】02556037 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロラクチン / ラジオレセプタ- / ラジオイムノアッセ- / レセプタ- / 固定化レセプタ- / ラジオレセプタ-アッセ- / プロラクチンレセプタ- / 標識プロラクチン

【研究成果の概要】

プロラクチンは、標的器官の細胞膜に存在する受容体に結合してプロラクチン刺激を伝える。shiu等は、プロラクチンが受容体に結合する親和性とプロラクチンの持つ生物活性値との問に高い相関関係があることを示した。近年になりプロラクチンの多様性が明らかになり、生物活性値も非常に異なることが明らかになった。受容体は、これらプロラクチンと結合の親和性に差があることから、ラジオイムノアッセ-の持つ欠点を解決出来るのではと考えられた。本研究では、一般に広く用いられているミクロゾ-ムの代わりに、膜タンパク質を表面活性剤を用いて可溶化し、ニトロセルロ-ス膜に固定し、バラ付きの原因を少なくすると共に、操作の容易化をはがった。トリトンXー100によりミクロゾ-ムを日溶化し、コンカナバリンAアフィニティ-クロマトにより部分精製し、ニトロセルロ-ス膜に固定した。アッセ-方法の検定は、ウシ血清を用い、内因性のプロラクチンはラジオイムノアッセ-により同時に測定し、ラジオレセプタ-と比較検討した。本方法では、標準プロラクチン0.4〜20ng/mlとで用量反応が認められ血清を16%まで加えても非特異的反応は認められなかった。又、ラジオイムノアッセ-とラジオレセプタ-アッセ-間で比較しても、ほぼ等しい値が得られ、相関係数も+0.99という高い値が得られた。ゲルロ過の結果においても、血中プロラクチンとのみ反応していることが明らかとなり、当初の目的を達成出来た。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1991

【配分額】4,700千円 (直接経費: 4,700千円)

【研究分野】畜産学

【研究領域課題番号】01480090 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞培養 / 乳腺 / コラ-ゲンゲル / 乳蛋白質 / 遺伝子 / カゼイン / プロラクチン / レセプタ- / 乳腺上皮 / カゼイン分泌 / αカゼイン / βカゼイン / 抗カゼイン抗体 / プロラクチンレセプタ- / カゼインcDNA

【研究成果の概要】

多数のホルモンの作用によって多種類の蛋白質を合成する乳腺の遺伝子発現系を解明するためには、無血清細胞培養系を確立するとともに、その蛋白質産物をアッセイする系を構築すること、また、乳蛋白質をコ-ドする遺伝子の転写を調べるためのプロ-プをクロ-ニングし、さらに、一ー乳蛋白質の合成を指令するプロラクチンの情報を細胞内に伝達する機構を解明するため、レセプタ-の性質を研究することが不可欠である。この目的にそって行われた本研究で、以下の成果を得た。
1. 浮遊コラ-ゲンゲンル細胞培養法によってマウス乳腺を培養し、培養液中に乳蛋白質を合成・分泌させ、カゼインをウェスタ-ンブロットにより検出した。さらに、マウスのαおよびΒカゼインをそれぞれ認識するもノクコ-ナル抗体を作った。この実験系を用いて、乳腺を最終分化させるためのホルモンはインシュリン+グルココルチコイド+プロラクチンであることが確認した。ビタミンDの分化誘導作用を検討したが、ビタミンDはグルココルチコイドにかわることができない。
2. 乳蛋白質の遺伝子のうち、ΒカゼインのcDNAおよびゲノムDNAはすでにクロ-ニングされており、酸性乳清蛋白質のcDNAもクロ-ニングされている。本研究では、αカゼインのcDNAのクロ-ニングを試みており、いくつかのクロ-ンを得ており、現在、塩基配列を分析中である。そのほかに、分子量4ー5万の乳蛋白質をコ-トするcDNAの断片とそのゲノムのDNAをクロ-ニングした。まだ、完全な同定は終わっていない。
3. 兎乳腺のプロラクチンレセプタ-を認識するモノクロ-ナル抗体を作り、これを用いて乳腺のレセプタ-を解析した。乳腺のプロラクチンレセプタ-には分子量8万と4万の2種類が存在する。ペプチドマッピングの結果、分子量4万のレセプタ-は分子量8万のレセプタ-の一部であることが明らかとなった。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1989 - 1990

【配分額】6,800千円 (直接経費: 6,800千円)

【研究分野】動物形態・分類学

【研究領域課題番号】63480026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生殖腺刺激ホルモン / プロラクチン / 抗体 / 受容体 / 両生類 / ヒキガエル / ウシガエル / 進化 / アフリカツメガエル / 分子構造

【研究成果の概要】

両生類を中心として、脳下垂体のペプチドホルモンを純化し、その抗体を作製し、また受容体との結合性を調べ、両生類の系統学的特徴をこれまでと違った立場から明らかにしようとした。その成果を述べる。1)生殖腺刺激ホルモン(GTH)の純化と、その抗体の種特異性:ヒキガルの脳下垂体から濾胞刺激ホルモン(FSH)と黄体形成ホルモン(LH)を純化し、それらの抗体を作製した。交差反応実験からヒキガエルに免疫学的に似てはいるが明らかに異なるFSHとLHの分子が存在すること、これらの分子は両生類のうちヒキガエルとオオヒキガエルとでは似ているが、ヒキガエルとウシガエルとではかなり異なり、鳥類や哺乳類とはもっと異なることが分った。2)GTH受容体のFSH/LH特異性:ウシガエル精巣のGTH受容体には、FSHの作用を伝えるものと、LHの作用を伝えるものの2種類があっても、それらのホルモン結合部位はFSHとLHを区別出来ないことが明らかとなった。すなわち、ウシガエルではホルモン分子は完全に二つに分化していても、その受容体の分子のほうはまだ完全には分化していないことが、明らかにされた。このために、一方のホルモンが他方のホルモンの競合阻害をおこす可能性が考えられるが、これもFSHはLHの結合に正の共同作用を示すことが明かとなり、少なくとも、FSHはLHの競合阻害物とはなりにくくする機構があることが分かった。3)ウシガエルのプロラクチンに対する抗血清はヒキガエルのプロラクチンとは交差反応を示すが、哺乳類のものとは交差しないことが明かにされた。4)以上及び他の研究から、有尾両生類やアフリカツメガエルの類は高等な脊椎動物の祖先に比較的近いが、RanaやBufoのような無尾両生類はかなり特異的に分化したグル-プではないかと結論された。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1988 - 1989

【配分額】6,400千円 (直接経費: 6,400千円)