【研究領域課題番号】18K06079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物化学 / X線結晶構造解析 / ABC輸送体 / 膜蛋白質 / 薬剤耐性 / 構造生物学 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析 / 膜輸送体

【研究成果の概要】

本研究では、ATPを利用して基質を能動輸送するATP-binding cassette（ABC）輸送体のうち、外膜チャネルと膜融合蛋白質と複合体を形成して基質の輸送を行う三者複合体形成型輸送体MacBについて、その基質輸送機構を解明することを目的とした。2017年に我々は分解能3.4オングストロームでMacBの結晶構造を明らかにしたが、本研究では新たに別のMacBホモログで分解能2.0オングストロームのより精密な構造解析に成功した。さらに複数の別条件の結晶からも構造を得た。それらの構造を比較することにより、MacBの構造変化が観察され、基質輸送機構の理解につながる新たな知見が得られた。

【研究の社会的意義】

本研究の対象であるMacBは、マクロライド系抗生物質やペプチド毒素、リポ多糖等の生物学的に重要な物質の排出に関与しており、その排出機構を解明することは、創薬のみならず生命現象の理解という観点からも非常に有用な情報が引き出せると期待される。本研究で明らかとなったMacBの構造変化は、従来のABC輸送体とは大きく異なるものであった。これらの結果から、詳細が解明されていないMacBを含むVII型ABC輸送体の基質輸送の分子機構について、新たなモデルを提唱した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】17K15087 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜輸送体 / 結晶構造解析 / 結核菌 / X線結晶構造解析

【研究成果の概要】

バクテリアの膜輸送体の構造解析のための発現ホストとしては大腸菌しかほぼ成功例がなく、大腸菌で発現できない膜輸送体の研究は困難である。特に結核菌を含む高GCグラム陽性菌群の膜輸送体の高発現に成功した例は極端に少ない。そこで、本研究では、医学的、学術的に重要な結核菌由来の膜輸送体の発現系の構築を試みた。発現ホストの膜構造と脂質組成に着目し、非病原性で結核菌と同属のMycobacterium smegmatisを蛋白質発現のホストとした。その結果、結核菌由来の2つの膜輸送体CtpFとMntHの発現系を構築することができた。

【研究の社会的意義】

本研究で対象とする膜輸送体はすべて、宿主マクロファージ内での結核菌の長期生存に重要である。従って、本研究により、長期にわたってヒトの細胞内で生存するために、結核菌がどのようにして宿主内の免疫系に適応しているのか、その一端が明らかになることが期待される。将来的に、これらの膜輸送体の機能解析、阻害剤の探索などの研究が進めば、新規抗結核薬の開発につながると考えている。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】25650023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜輸送体 / 結晶構造解析 / 創薬 / 輸送体 / トランスポーター / X線結晶構造解析

【研究成果の概要】

膜輸送体は、多くの病気に関係している。そのためヒト由来の膜輸送体は重要な創薬ターゲットであり、その立体構造情報は機能解明ばかりか効率的な創薬にも役立つ。しかし、不安定な哺乳類由来の膜輸送体は結晶化・構造解析が困難であった。我々は、膜タンパク質の構造解析分野で最新の手法である立体構造認識抗体を用いた結晶化方法とLipidic cubic phase法を用いた結晶化方法を哺乳類由来の膜輸送体の構造解析に応用した。その結果、いくつかのもので結晶化に成功し、ヒト由来膜輸送体の迅速な構造決定の実現性が高まった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】25291011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 多剤耐性菌 / 膜輸送体 / Ｘ線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 薬物動態

【研究成果の概要】

多剤排出輸送体は，多様な薬剤を認識し排出することで薬物耐性細胞出現の原因となっている．この幅広い薬剤に対する認識・排出機構の理解は，創薬の観点からも重要である．しかし，膜蛋白質の構造解析は困難であり，近年いくつかの多剤排出輸送体の構造が解明されたが，分解能の低さのため，基質認識など生物学的に重要な点が依然不明のままである．本研究では，多剤排出輸送体として同定され，その後の研究により芳香族アミノ酸も排出する輸送体と判明したYddGの構造機能解析を行った．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】24227004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / チャネル / トランスポーター / 遺伝学 / 電気生理学 / 膜輸送体 / リポソーム解析 / 計算機シミュレーション / 遺伝学解析 / パッチクランプ / 高分子構造・物性 / X線 / 生体分子 / タンパク質 / 薬理学

【研究成果の概要】

イオンチャネルに関しては，新規に同定したMg2+チャネルMgtE，TRICチャネル，P2Xチャネルに関して高分解能の結晶構造に基づき，基質認識機構，輸送制御機構を解明した.トランスポーターに関しては，Ca2+/H+交換輸送体CAX，Fe2+排出輸送体FPN，糖の排出輸送体SWEET，ペプチド輸送体POT，アミノ酸排出輸送体YddG，多剤排出輸送体MATE，膜蛋白質の膜組み込みに働くYidCの高分解能構造を決定し，基質認識機構，輸送機構を解明した.また，チャネルロドプシン，光駆動型Na+ポンプKR2の高分解能構造を決定し，光による輸送駆動機構を解明した.

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2012-05-31 - 2017-03-31

【配分額】217,880千円 (直接経費: 167,600千円、間接経費: 50,280千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】22687007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X 線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 膜輸送体 / ドラッグデリバリー / 多剤排出因子 / X線結晶構造解析

【研究成果の概要】

細胞内外の環境維持に重要な能動輸送体は,エネルギーを消費して細胞膜を介した物質輸送を行う膜蛋白質であり,二次性輸送体は一次性輸送体が作り出したH+,Na+等のイオンの濃度勾配をエネルギー源として,低分子化合物を能動的に輸送する役割を持つ.特にこの二次性輸送体は,アミノ酸,核酸,糖,薬剤など,重要な生理活性物質の細胞内外の分布を決定づけている.そのため,これらの輸送体のヒトにおける機能異常は様々な疾病と深く関係している.本研究は,生物学的,医学的応用の両面から重要である二次性能動輸送体,多剤排出輸送体MATE,Ca2+カチオン交換体CaCA,オリゴペプチド輸送体POTのX線結晶構造解析・機能解析を行った.

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】20227003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X 線結晶構造解析 / チャネル / トランスポーター / 電気生理学解析 / 遺伝学解析 / X線結晶構造解析 / 計算機シミュレーション / パッチクランプ / 膜輸送体 / 電気生理学 / 遺伝学

【研究成果の概要】

輸送体膜蛋白質は,金属イオン,糖,代謝産物,薬剤などの細胞内への取込みおよび細胞外への排出を厳密に制御し,細胞内の環境を適切に保っている.本研究では,マグネシウム輸送体,鉄輸送体および重金属輸送体などの金属イオン輸送体,光感受性陽イオンチャネル,蛋白質膜透過輸送体,ペプチド輸送体,多剤排出輸送体に関して,(1)X線結晶構造解析による構造的基盤の解明,(2)分子動力学(MD)シミュレーションによる動的側面の解明,(3)in vivo/vitroにおける機能解析による実験的な検証の3つの手法を協奏的に駆使し,(A)その機能本体である輸送の機構,(B)輸送基質の選択機構,(C)輸送の制御機構の3点に着目し、膜輸送体が生命活動を維持するメカニズムを解明した.特に、様々な種類の基質に特異的な膜輸送体の作動機構を比較・統合することにより、膜輸送の本質的なメカニズムを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2008-05-12 - 2013-03-31

【配分額】207,870千円 (直接経費: 159,900千円、間接経費: 47,970千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】19207009 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

多剤排出トランスポーター / 結晶化 / X線結晶構造解析 / 多剤耐性 / 膜輸送 / 構造解析 / 薬剤耐性 / 構造生物学 / 線結晶構造解析 / 膜輸送体 / トランスポーター

【研究成果の概要】

院内感染などに見られる多剤耐性化の主要な原因の一つであるRND型多剤排出トランスポーターの作動メカニズムの本質的理解を目指し、立体構造情報の高解像度化を進めるとともに、得られた結晶構造に基づく機能解析を進めた。得られた結晶構造に基づく蛋白質工学的解析を行い、基質透過経路のなかほどに基質選択性に関わるフィルター様の働きを持つ部位を見いだした。また、これまで極めて困難であったRND型トランスポーターの直接的な生化学的解析を行う手法としてグラム陽性細菌由来のRNDトランスポーターホモログを用いる方法を考案した。グラム陽性細菌由来RND型トランスポーターにおける薬剤排出研究はこれまでほとんど行われてこなかったが、グラム陽性菌のRND型トランスポーターも実際に薬剤を排除することが実験的に示された。また、これらのターゲットとした膜蛋白質の大量発現に成功し、結晶化が可能な高純度のサンプルを得ることにも成功している。それらの結晶化に際し、フェムト秒レーザー照射や微量溶液撹拌のほか、新たに開発中の高濃度アガロースゲル中での結晶化など新たな結晶化技術の開発し特許申請を行うと共に、それらを適用して現在もトランスポーターの結晶化を行った。大腸菌AcrBについてはは分解能が2.5Å分解能にまで向上した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】42,380千円 (直接経費: 32,600千円、間接経費: 9,780千円)